共転写RNA処理イベントを解剖するための人工RNAポリメラーゼII伸長複合体

真核生物メッセンジャーRNA(mRNA)合成は、RNAポリメラーゼIIによる未処理前駆体RNAの合成および成熟したmRNAを得るための前駆体RNAの処理を含む精巧な生化学的プロセスである。キャッピング、スプライシング、およびポリアデニル化のRNA処理ステップは、主に共写的に行われる。Pol II伸長複合体は、RNA処理酵素の多くの活動を募集し、調整する足場として機能します。その結果、成熟した真核生物mRNAがどのように生成されるかについての我々の究極の理解は、伸長複合体への募集の基礎となる生化学的メカニズムの解剖を可能にする実験システムの開発に大きく依存し、共転写キャッピング、スプライシング、およびポリアデニル化を担当する酵素の調節。

当然のことながら、このような実験システムの開発は困難であった。主な障害は、単にインビトロでPol IIによって基底転写を再構成するだけで、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、およびTFIIHの5つの一般的な転写開始因子の最小セットを必要とするPol II転写自体の顕著な複雑さでした。さらに、インビトロで規制されたPol II転写の任意の並べ替えを再構成するには、転写因子と共レギュレータのより大きなセットが必要です。したがって、主な目標は、Pol II転写およびRNA処理の機能結合の研究に適した活性Pol II伸長複合体の再構成を可能にする、より単純な実験システムを開発することである。

活性Pol II伸長複合体を再構成するためのそのようなより簡単な方法の1つは、細長いPol IIの構造および生化学的研究に有用であることが証明されており、さらに最近では、共転写RNA処理2、3を研究するために有用である。 、4、⁵.本稿では、精製されたPol IIと合成転写気泡から調製されたPol II伸長複合体を効果的に使用して、新生Pol II転写物の共転写キャッピングのメカニズムを調べることができる方法を示す。

キャッピングとは、5′-グアノシン「キャップ」を、生まれつきのPol II転写物の5′-三リン酸末端に共生添加することをいう。キャップは、mRNAの成熟、輸送、翻訳、およびその他のプロセス6、7の後続のステップで重要です。キャップは、キャッピング酵素と呼ばれる酵素によってPol II転写物に共写物を添加する。哺乳動物細胞において、キャッピング酵素のRNA 5′-三ホスファターゼおよびグアニリルトランスフェラーゼ活性を担う活性部位は、単一のポリペプチド8内に含まれる。キャッピング酵素は、そのヘプタペプチドのSer5上でリン酸化されたPol II体およびRpb1カルボキシ末端ドメイン(CTD)上の未定義の表面との相互作用を通じてPol II伸長複合体に募集される5。伸長複合体では、キャッピング酵素は、生まれつき転写物が少なくとも18ヌクレオチドの長さに達し、ポリメラーゼRNA出口チャネルから出現した後、5′-グアノシンキャップの添加を触媒する。キャッピング反応の最初のステップでは、三ホスファターゼはRNA 5′-三リン酸を加水分解し、5′–二リン酸を得る。第2工程では、GTPをグアニチルトランスフェラーゼによってGMPに加水分解し、GMPキャッピング酵素中間体を形成する。最後に、グアニュリルトランスフェラーゼは、GMPを生まれつき転写物の5′-二リン酸末端に移し、キャップを産生する。

キャッピング反応の顕著な特徴は、同写物キャッピング(すなわち、機能的Pol II伸長複合体に関連する転写物のキャッピング)が遊びRNA5,9のキャッピングよりもはるかに効率的である。したがって、この分野の大きな問題は、キャッピングのこの劇的な活性化がPol II伸長複合体とのキャッピング酵素の相互作用によってどのように達成されるのかである。このプロトコルでは、精製されたRNAポリメラーゼIIおよび人工転写気泡のみを用いた活性RNAポリメラーゼII伸長複合体の組み立てについて説明する。これらの方法は、定義された長さと配列の転写物を有するRNAポリメラーゼII伸長複合体の作成を可能にする。最近の研究では、これらの定義されたRNAポリメラーゼII伸長複合体をRNAキャッピング5のメカニズムの側面を調査するためのモデルとして使用した。特に、これらの伸長複合体に関連するRNAのキャッピングは、遊値RNAのキャッピングよりも100倍以上効率的であり、(ii)はPol II CTDのTFIIH依存性リン酸化によって刺激されたことを示した。ここで説明するアプローチは、原則として、Pol II伸長複合体にリンクされた他の共転写RNA処理反応を研究するための基板を生成するように適合させることができる。

このプロトコルのセクション1では、人工伸び複合体は、合成テンプレート鎖DNAオリゴヌクレオチドを、テンプレート鎖DNAの約9ヌクレオチドに対してその3’末端で相補的であるRNAオリゴヌクレオチドにアニールすることによって作成される。次に、Pol II が DNA:RNA 二重鎖にロードされます。伸長複合体は、その3’末端でビオチンで標識された部分的に相補的な非テンプレート鎖DNAオリゴヌクレオチドを添加することによって完了する(図1および図2A)。RNAオリゴヌクレオチドは、これらの伸長複合体におけるPol IIによって拡張され、放射性標識ヌクレオチドの適切な組み合わせの添加時に定義された長さと配列の放射標識転写物を作る。さらに、未組み込みのヌクレオチドを除去するワッシュの組み合わせを使用して、ヌクレオチドの異なる組み合わせをさらに添加し、1つは、DNAテンプレートに沿って異なる位置にPol IIを「歩く」と定義された長さのRNAを合成することができます。RNAは次いで精製され、尿素-PAGEゲルを脱ナーチジンで電気泳動を受ける。プロトコルのセクション2では、人工伸長複合体が共転写RNAキャッピングを分析するために使用される。提示された例は、共転写RNAキャッピングに対するPol II CTDのTFIIH依存リン酸化の効果を測定する。本実験では、キャッピング酵素濃度(反応当たり5、15、45ng)と時間(1、2、4分)の関数として、共写物キャッピングの程度を測定した。