Complexos artificiais de alongamento de RNA polimerase II para dissecar eventos co-transcricionais do processamento de RNA

A síntese do RNA do mensageiro eucariótico (mRNA) é um processo bioquímico elaborado que envolva a síntese de um RNA precursor não processado pelo RNA polymerase II e Processando do RNA do precursor para render o mRNA maduro. As etapas de processamento do RNA de nivelamento, de emenda, e de poliadenilação são executadas pela maior parte co-transcripcionalmente. O complexo de alongamento pol II serve como um andaime que recruta e orquestra as atividades de muitas das enzimas de processamento de RNA. Conseqüentemente, nossa compreensão final de como os mRNAs eucarióticas maduros são gerados dependerá pesadamente no desenvolvimento de sistemas experimentais para permitir a dissecção dos mecanismos bioquímicos que subjacentes o recrutamento ao complexo do alongamento e regulação das enzimas responsáveis pelo nivelamento, splicing e poliadenilação cotranscricional.

Não surpreendentemente, o desenvolvimento de tais sistemas experimentais tem sido difícil. Um grande impedimento tem sido a notável complexidade da própria transcrição de pol II, onde simplesmente reconstituir a transcrição basal por pol II in vitro requer um conjunto mínimo de cinco fatores gerais de iniciação de transcrição: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF e TFIIH ¹. Além disso, reconstituindo qualquer tipo de pol II regulamentada transcrição in vitro requer um conjunto ainda maior de fatores de transcrição e coregulators. Assim, um objetivo principal foi desenvolver sistemas experimentais mais simples que permitam a reconstituição de complexos de alongamento ativos de pol II adequados para investigações do acoplamento funcional da transcrição de pol II e do processamento de RNA.

Um método mais simples para a reconstituição de complexos de alongamento ativos de pol II provou ser útil para estudos estruturais e bioquímicos de alongamento pol II e, mais recentemente, para investigar o processamento de RNA co-transcricional^{2,3 ,4,5}. Neste artigo, nós mostramos como os complexos do alongamento de pol II preparados das bolhas purificadas de pol II e de transcrição sintética podem ser usados eficazmente para investigar os mecanismos que subjacentes o nivelamento co-transcriptional de transcritos nascente de pol II.

Tampando refere-se à adição covalente de um 5 ‘-guanosina “tampão” para o 5 ‘-trifosfato final de nascente pol II transcrições. A PAC é importante para etapas subsequentes da maturação do mRNA, transporte, tradução e outros processos^6,7. O tampão é adicionado co-transcripcionalmente aos transcritos de pol II por uma enzima referida como a enzima tampando. Em células de mamíferos, locais ativos responsáveis pelas atividades de RNA 5 ‘-trifosfatase e guanil transferase da enzima tampando estão contidos em um único polipeptídeo⁸. A enzima tampando é recrutada para o complexo de alongamento de pol II através de interações com superfícies ainda definidas no corpo de pol II e o domínio Rpb1 carboxy-terminal (CTD) fosforilado em Ser5 de suas repetições de heptapeptídeo⁵. No complexo do alongamento, a enzima tampando catalisa a adição de um tampão de 5 ‘-guanosine uma vez que o transcrito nascente alcança um comprimento de pelo menos 18 nucleotídeos e emergiu do canal da saída do RNA do polymerase. Na primeira etapa da reação tampando, o triphosphatase hidrolisa o RNA 5 ‘-triphosphate para render um 5 ‘-diphosphate. Na segunda etapa, o GTP é hidrolisado para GMP pelo guanil transferase, formando um intermediário de enzima GMP-tampando. Finalmente, o transferase do guanil transfere o PBF à extremidade 5 ‘-diphosphate do transcrito nascente para produzir a tampa.

Uma característica notável da reação tampando é que o nivelamento co-transcriptional (isto é, tampando dos transcritos associados com os complexos funcionais do alongamento de pol II) é muito mais eficiente do que tampando do RNA livre^5,9. Assim, uma grande questão no campo tem sido como esta ativação dramática de nivelamento é alcançada através de interações da enzima tampando com o complexo de alongamento pol II. Neste protocolo nós descrevemos o conjunto de complexos ativos do alongamento do polymerase II do RNA que usam somente o polymerase purificado II do RNA e bolhas artificiais da transcrição. Estes métodos permitem a criação de complexos de alongamento de RNA polimerase II com transcrições de comprimento e seqüência definidos. Em um estudo recente, utilizamos estes complexos de alongamento de RNA polimerase II definidos como um modelo para investigar aspectos dos mecanismos do RNA tampando⁵. Em particular, nós mostramos que (i) o nivelamento do RNA associado com estes complexos do alongamento era mais do que 100-fold mais eficiente do que tampando do RNA livre e (II) foi estimulado pela fosforilação TFIIH-dependente do pol II CTD. A abordagem aqui descrita poderia, em princípio, ser adaptada para gerar substratos para o estudo de outras reações de processamento de RNA cotranscricional ligadas ao complexo de alongamento pol II.

Na seção 1 deste protocolo, os complexos artificiais do alongamento são criados recozimento um oligonucleotide sintético da vertente do ADN do molde a um oligonucleotide do RNA que seja complementar em seus 3 ‘-extremidade a aproximadamente 9 nucleotídeos do ADN da costa do molde. Pol II é então carregado no DNA: RNA duplex. O complexo do alongamento é terminado então pela adição de um oligonucleotide parcialmente complementar, do ADN da vertente do não-molde que seja etiquetado com a biotina em seus 3 ‘-extremidade (Figura 1 e Figura 2a). O oligonucleotide do RNA é estendido por pol II nestes complexos do alongamento para fazer transcritos radiolabeled do comprimento e da seqüência definidos em cima da adição de combinações apropriadas de nucleotides radiolabeled. Além disso, usando uma combinação de lavagens para remover nucleotídeos não incorporados e adição adicional de diferentes combinações de nucleotídeos, pode-se “andar” pol II para diferentes posições ao longo do modelo de DNA e sintetizar RNA de comprimentos definidos. O RNA é então purificado e submetido à eletroforese em géis de desnaturação da ureia. Na seção 2 do protocolo, complexos de alongamento artificial são usados para analisar a tampagem de RNA cotranscricional. O exemplo apresentado mede o efeito da fosforilação TFIIH-dependente do pol II CTD sobre a tampagem de RNA cotranscricional. Neste experimento, medimos a extensão do nivelamento cotranscricional em função da concentração da enzima tampando (5, 15 e 45 ng por reação) e tempo (1, 2 e 4 min).