Complessi di allungamento dell'RNA artificiale Polymerase II per eventi di elaborazione dell'RNA co-trascrizione
Summary
Qui, descriviamo l’assemblaggio di complessi di allungamento della polimerasi RNA II (Pol II) che richiedono solo brevi oligonucleotidi di DNA sintetico e RNA e Pol II purificati. Questi complessi sono utili per studiare i meccanismi alla base dell’elaborazione co-trascrizione delle trascrizioni associate al complesso di allungamento di Pol II.
Abstract
La sintesi dell’mRNA eucariotico è un complesso processo biochimico che richiede la trascrizione di un modello di DNA in un RNA precursore da parte dell’enzima multi-subunità RNA polymerase II e il capping e giunzione co-trascrizione dell’RNA precursore per formare l’mRNA maturo. Durante la sintesi dell’mRNA, il complesso di allungamento dell’RNA polimerasi II è un obiettivo per la regolazione da parte di una vasta raccolta di fattori di trascrizione che controllano la sua attività catalitica, così come il capping, lo splicing e 3’enzimi che elaborano l’mRNA maturo. A causa della complessità intrinseca della sintesi dell’mRNA, sistemi sperimentali più semplici che consentono l’isolamento e l’indagine delle sue varie fasi co-trascrizioni hanno una grande utilità.
In questo articolo, descriviamo uno di questi semplici sistemi sperimentali adatti per studiare il capping dell’RNA co-trascrizione. Questo sistema si basa su complessi di allungamento definiti per la polimerasi II, assemblati da polimerasi purificate e bolle di trascrizione artificiale. Quando immobilizzati tramite DNA biotinylato, questi complessi di allungamento dell’RNA polimerasi II forniscono uno strumento facilmente manipolabile per distrusire il capping dell’RNA co-trascrizione e i meccanismi con cui il complesso di allungamento recluta e regola l’enzima di capping durante il ceforo co-trascrizione dell’RNA. Prevediamo che questo sistema potrebbe essere adattato per studiare il reclutamento e/o l’assemblaggio di proteine o complessi proteici con ruoli in altre fasi della maturazione dell’mRNA accoppiato al complesso di allungamento della polimerasi II.
Introduction
La sintesi dell’RNA del messaggero eucaico (mRNA) è un processo biochimico elaborato che comporta la sintesi di un RNA precursore non elaborato mediante polimerasi RNA II e l’elaborazione dell’RNA precursore per produrre l’mRNA maturo. Le fasi di lavorazione dell’RNA di capping, splicing e poliadenilazione vengono eseguite in gran parte co-trascrizione. Il complesso di allungamento di Pol II funge da scaffold che recluta e orchestra le attività di molti degli enzimi di elaborazione dell’RNA. Di conseguenza, la nostra comprensione finale di come vengono generati mRNA eucarici maturi dipenderà fortemente dallo sviluppo di sistemi sperimentali per consentire la dissezione dei meccanismi biochimici alla base del reclutamento nel complesso di allungamento e regolazione degli enzimi responsabili del capping co-trascrizione, giunzione e poliadenilazione.
Non sorprende che lo sviluppo di tali sistemi sperimentali sia stato difficile. Un grande impedimento è stata la notevole complessità della trascrizione di Pol II in cui la semplice riaffermazione basale di Pol II in vitro richiede un insieme minimo di cinque fattori generali di inizio trascrizione: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIFi e TFIIH 1. Inoltre, la ricostituzione di qualsiasi tipo di trascrizione regolamentata di Pol II in vitro richiede una serie ancora più ampia di fattori di trascrizione e coregolatori. Pertanto, uno degli obiettivi principali è stato quello di sviluppare sistemi sperimentali più semplici che consentissero la ricostituzione di complessi di allungamento Attivi Di Pol II adatti per le indagini sull’accoppiamento funzionale della trascrizione di Pol II e sull’elaborazione dell’RNA.
Uno di questi metodi più semplici per la ristorazione dei complessi di allungamento attivi di Pol II si è dimostrato utile per studi strutturali e biochimici di allungamento di Pol II e, più recentemente, per studiare l’elaborazione co-trascanante dell’RNA di Pol II2,3 ,4,5. In questo articolo, mostriamo come i complessi di allungamento di Pol II preparati da Pol II purificati e bolle di trascrizione sintetica possono essere utilizzati in modo efficace per studiare i meccanismi alla base del limite co-trascrizione delle trascrizioni nascenti di Pol II.
Il capping si riferisce all’aggiunta covalente di un “cap” da 5′-guanosina alla fine di 5′-triposfato delle neofite trascrizioni di Pol II. Il tappo è importante per i passaggi successivi di maturazione dell’mRNA, trasporto, traduzione e altri processi6,7. Il tappo viene aggiunto co-transcriptionally alle trascrizioni di Pol II da un enzima indicato come enzima capping. Nelle cellule dei mammiferi, i siti attivi responsabili delle attività di transferase RNA 5′-triphosphatase e guanylyl dell’enzima capping sono contenuti all’interno di un singolo polipeptide8. L’enzima di tappatura viene reclutato nel complesso di allungamento di Pol II attraverso interazioni con superfici ancora da definire sulla carrozzeria Pol II e sul fosforo di dominio carboxy-terminale Rpb1 (CTD) sul Ser5 delle sue ripetizioni di eptapeptide5. Nel complesso di allungamento, l’enzima cadentizza l’aggiunta di un cappuccio da 5′-guanosina una volta che la trascrizione nascente raggiunge una lunghezza di almeno 18 nucleotidi ed è emersa dal canale di uscita dell’RNA polimerasi. Nella prima fase della reazione di tappatura, il tripfolo idrofolosa l’RNA 5′-trifosfato per produrre un difosfato 5′. Nella seconda fase, GTP è idrolyzed a GMP dal goanylyl transferase, formando un enzima GMP-capping intermedio. Infine, il trasferimentogu guanylyl trasferisce GMP all’estremità 5′-diphosphate della trascrizione nascente per produrre il tappo.
Una caratteristica notevole della reazione di tappatura è che il limite co-trascrizione (cioè il limite delle trascrizioni associate ai complessi di allungamento funzionale Pol II) è molto più efficiente del limite di RNA libero5,9. Così, una domanda importante nel campo è stata come questa drammatica attivazione del capping si ottiene attraverso le interazioni dell’enzima capping con il complesso di allungamento Di Pol II. In questo protocollo descriviamo l’assemblaggio di complessi di allungamento active RNA polimerasi II utilizzando solo bolle di polimerasi di RNA purificate II e di trascrizione artificiale. Questi metodi consentono la creazione di complessi di allungamento della polimerasi iI dell’RNA con trascrizioni di lunghezza e sequenza definite. In uno studio recente, abbiamo usato questi complessi di allungamento dell’RNA Polymerasi II definiti come modello per studiare gli aspetti dei meccanismi dell’RNA capping5. In particolare, abbiamo dimostrato che il (i) tappatura dell’RNA associato a questi complessi di allungamento era più di 100 volte più efficiente del limite di RNA libero e (ii) è stato stimolato dal fosforolazione dipendente da TFIIH della Pol II CTD. L’approccio qui descritto potrebbe in linea di principio essere adattato per generare substrati per studiare altre reazioni di elaborazione dell’RNA co-trascrizione legate al complesso di allungamento di Pol II.
Nella Sezione 1 di questo protocollo, i complessi di allungamento artificiale vengono creati annealing un modello sintetico filamento DNA oligonucleotide a un oligonucleotide RNA che è complementare alla sua fine 3′-end a circa 9 nucleotidi del DNA filante modello. Pol II viene quindi caricato sul DNA:RNA duplex. Il complesso di allungamento viene quindi completato con l’aggiunta di un DNA filato parzialmente complementare, non modello, oligonucleotide che è etichettato con biotina alla sua fine 3′-fine (Figura 1 e Figura 2A). L’oligonucleotide dell’RNA viene esteso da Pol II in questi complessi di allungamento per creare trascrizioni radioetichettate di lunghezza e sequenza definite dopo l’aggiunta di combinazioni appropriate di nucleotidi radioetichettati. Inoltre, utilizzando una combinazione di lavatoi per rimuovere i nucleotidi non incorporati e l’ulteriore aggiunta di diverse combinazioni di nucleotidi, si può “camminare” Pol II in diverse posizioni lungo il modello di DNA e sintetizzare RNA di lunghezze definite. L’RNA viene quindi purificato e sottoposto a elettroforesi nei gel di denatura urea-PAGE. Nella Sezione 2 del protocollo, i complessi di allungamento artificiale vengono utilizzati per analizzare il capping dell’RNA co-trascrizione. L’esempio presentato misura l’effetto del fosfororylazione dipendente da TFIIH del CTD Pol II sul limite dell’RNA co-trascrizione. In questo esperimento, misuriamo l’estensione del tappo co-trascrizione in funzione della concentrazione di enzimi capping (5, 15 e 45 ng per reazione) e il tempo (1, 2 e 4 min).
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli studi che cercano di sezionare gli eventi accoppiati al complesso di allungamento di Pol II come l’elaborazione dell’RNA e la regolazione dell’allungamento della trascrizione stessa possono essere notevolmente facilitati dall’uso di un sistema enzimatico altamente purificato. La creazione di tali sistemi enzimatici può essere difficile. La trascrizione dipendente dal promoter da Pol II richiede almeno cinque fattori generali di trascrizione. La preparazione e l’accumulo di questi fattori possono richiedere mesi; qui…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo S. Shuman per aver fornito al mammifero l’enzima cDNA. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione allo Stowers Institute for Medical Research dell’Helen Nelson Medical Research Fund presso la Greater Kansas City Community Foundation. I dati originali sottostanti questo manoscritto sono accessibili dal Stowers Original Data Repository di http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.
Materials
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/ml) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 ml) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/ml) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
References
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