Complejos de alargamiento de ARN polimerasa artificial II para disecar eventos de procesamiento de ARN co-transcripcional
Summary
Aquí, describimos el conjunto de complejos de alargamiento de ARN polimerasa II (Pol II) que requieren sólo ADN sintético corto y oligonucleótidos de ARN y Pol II purificado. Estos complejos son útiles para estudiar los mecanismos subyacentes al procesamiento co-transcripcional de transcripciones asociadas con el complejo de elongación Pol II.
Abstract
La síntesis de ARNm eucariota es un proceso bioquímico complejo que requiere la transcripción de una plantilla de ADN en un ARN precursor por la enzima multi-subunit ARN polimerasa II y el taponamiento y empalme co-transcripcional del ARN precursor para formar el ARNm maduro. Durante la síntesis de ARNm, el complejo de alargamiento de ARN polimerasa II es un objetivo de regulación por una gran colección de factores de transcripción que controlan su actividad catalítica, así como el tapón, empalme y enzimas de procesamiento de 3’que crean el ARNm maduro. Debido a la complejidad inherente de la síntesis de ARNm, los sistemas experimentales más simples que permiten el aislamiento y la investigación de sus diversas etapas co-transcripcionales tienen gran utilidad.
En este artículo, describimos uno de estos sistemas experimentales simples adecuados para investigar el taponamiento de ARN co-transcripcional. Este sistema se basa en complejos de elongación de ARN polimerasa II definidos ensamblados a partir de burbujas de transcripción artificial y polimerasa purificada. Cuando se inmovilizan a través de ADN biotinilado, estos complejos de alargamiento de ARN polimerasa II proporcionan una herramienta fácilmente manipulable para disuado de taponamiento de ARN co-transcripcional y mecanismos por los cuales el complejo de alargamiento recluta y regula la enzima de tapado durante límite de ARN co-transcripcional. Anticipamos que este sistema podría adaptarse para estudiar el reclutamiento y/o el ensamblaje de proteínas o complejos proteicos con funciones en otras etapas de maduración del ARNm acopladas al complejo de alargamiento de ARN polimerasa II.
Introduction
La síntesis de ARN mensajero eucariota (ARNm) es un elaborado proceso bioquímico que implica la síntesis de un ARN precursor no procesado por ARN polimerasa II y el procesamiento del ARN precursor para producir el ARNm maduro. Los pasos de procesamiento de ARN de tapado, empalme y poliadenilación se llevan a cabo en gran medida de forma co-transcripción. El complejo de alargamiento Pol II sirve como un andamio que recluta y orquesta las actividades de muchas de las enzimas de procesamiento de ARN. En consecuencia, nuestra comprensión última de cómo se generan los ARNm eucariotas maduros dependerá en gran medida del desarrollo de sistemas experimentales que permitan la disección de los mecanismos bioquímicos subyacentes al reclutamiento al complejo de alargamiento y regulación de las enzimas responsables de la limitación co-transcripción, empalme y poliadenilación.
No es de extrañar que el desarrollo de estos sistemas experimentales haya sido difícil. Un impedimento importante ha sido la notable complejidad de la propia transcripción de la Pol II, donde la simple reconstitución de la transcripción basal por Pol II in vitro requiere un conjunto mínimo de cinco factores generales de iniciación de la transcripción: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF y TFIIH 1. Además, la reconstitución de cualquier tipo de transcripción regulada de Pol II in vitro requiere un conjunto aún mayor de factores de transcripción y coreguladores. Por lo tanto, un objetivo importante ha sido desarrollar sistemas experimentales más simples que permitan la reconstitución de complejos de alargamiento activos de Pol II adecuados para la investigación del acoplamiento funcional de la transcripción de Pol II y el procesamiento de ARN.
Uno de esos métodos más sencillos para reconstituir complejos de alargamiento activos de la Pol II ha demostrado ser útil para los estudios estructurales y bioquímicos de alargamiento de la Pol II y, más recientemente, para investigar el procesamiento de ARN co-transcripcional2,3 ,4,5. En este artículo, mostramos cómo los complejos de elongación Pol II preparados a partir de Pol II purificado y las burbujas de transcripción sintética se pueden utilizar eficazmente para investigar los mecanismos subyacentes al taponamiento co-transcripcional de las nacientes transcripciones pol II.
El taponamiento se refiere a la adición covalente de una “tapa” de 5′-guanosina al extremo 5′-trifosfato de las nacientes transcripciones Pol II. El límite es importante para los pasos posteriores de maduración del ARNm, transporte, traducción y otros procesos6,7. La tapa se añade co-transcripcionalmente a las transcripciones de Pol II por una enzima conocida como enzima de taponamiento. En las células de mamíferos, los sitios activos responsables de las actividades de ARN 5′-trifosfatasa yguanylyl transferasa de la enzima de taponamiento están contenidos dentro de un solo polipéptido 8. La enzima de tapado se contrata para el complejo de elongación Pol II a través de interacciones con superficies aún por definir en la carrocería Pol II y el dominio carboxi-terminal Rpb1 (CTD) fosforilado en Ser5 de su heptapéptido repite5. En el complejo de alargamiento, la enzima de tapado cataliza la adición de una tapa de 5′-guanosina una vez que la transcripción naciente alcanza una longitud de al menos 18 nucleótidos y ha surgido del canal de salida del ARN polimerasa. En el primer paso de la reacción de taponamiento, la trifosfatasa hidroliza el ARN 5′-trifosfato para producir un 5′-difosfato. En el segundo paso, GTP es hidrolizado a GMP por la guanylyl transferasa, formando una enzima GMP-capping intermedia. Finalmente, la guanylyl transferasa transfiere GMP al extremo 5′-difosfato de la naciente transcripción para producir la tapa.
Una característica notable de la reacción de tapado es que el taponamiento co-transcripcional (es decir, el taponamiento detranscripciones asociadas con complejos de alargamiento funcional Pol II) es mucho más eficiente que el taponamiento del ARN libre 5,9. Por lo tanto, una pregunta importante en el campo ha sido cómo esta activación dramática de la tapado se logra a través de interacciones de la enzima de tapado con el complejo de elongación Pol II. En este protocolo describimos el ensamblaje de complejos de alargamiento activos de ARN polimerasa II utilizando únicamente ARN polimerasa II purificado y burbujas de transcripción artificial. Estos métodos permiten la creación de complejos de alargamiento de ARN polimerasa II con transcripciones de longitud y secuencia definidas. En un estudio reciente, utilizamos estos complejos de alargamiento de ARN polimerasa II definidos como modelo para investigar aspectos de los mecanismos de limitación de ARN5. En particular, mostramos que i) el taponamiento del ARN asociado a estos complejos de alargamiento era más de 100 veces más eficiente que el taponamiento del ARN libre y ii) fue estimulado por la fosforilación dependiente de TFIIH del CTD Pol II. El enfoque descrito aquí podría, en principio, adaptarse para generar sustratos para el estudio de otras reacciones de procesamiento de ARN co-transcripcional vinculadas al complejo de alargamiento Pol II.
En la sección 1 de este protocolo, los complejos de alargamiento artificial se crean recocidos de un oligonucleótido de ADN de hilo de plantilla sintética a un oligonucleótido de ARN que es complementario en su extremo 3 a aproximadamente 9 nucleótidos del ADN de la hebra de la plantilla. Pol II se carga entonces en el dúplex DNA:RNA. El complejo de alargamiento se completa mediante la adición de un oligonucleótido de ADN de cadena parcialmente complementario y no-plantilla que se etiqueta con biotina en su extremo 3 (Figura1 y Figura 2A). El oligonucleótido de ARN es ampliado por Pol II en estos complejos de alargamiento para hacer transcripciones radioetiquetas de longitud y secuencia definidas tras la adición de combinaciones apropiadas de nucleótidos radiomarcados. Además, utilizando una combinación de lavados para eliminar nucleótidos no incorporados y la adición adicional de diferentes combinaciones de nucleótidos, se puede “caminar” Pol II a diferentes posiciones a lo largo de la plantilla de ADN y sintetizar ARN de longitudes definidas. El ARN se purifica y se somete a electroforesis en geles de urea-PAGE desnaturalizantes. En la sección 2 del protocolo, los complejos de alargamiento artificial se utilizan para analizar el taponamiento de ARN co-transcripcional. El ejemplo presentado mide el efecto de la fosforilación dependiente de TFIIH del CTD Pol II en el taponamiento del ARN co-transcripcional. En este experimento, medimos el alcance del tapón co-transcripcional en función de la concentración de enzimas de taponamiento (5, 15 y 45 ng por reacción) y el tiempo (1, 2 y 4 min).
Protocol
Representative Results
Discussion
Los estudios que buscan diseccionar eventos acoplados al complejo de elongación Pol II como el procesamiento de ARN y la regulación del alargamiento de la transcripción en sí pueden ser facilitados en gran medida mediante el uso de un sistema enzimático altamente purificado. La configuración de estos sistemas enzimáticos puede ser un desafío. La transcripción dependiente del promotor por parte de la Pol II requiere al menos cinco factores de transcripción generales. Preparar y almacenar estos factores puede lle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a S. Shuman por proporcionar la enzima de tapado de mamíferos cDNA. Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención al Instituto Stowers para la Investigación Médica del Fondo de Investigación Médica Helen Nelson de la Greater Kansas City Community Foundation. Se puede acceder a los datos originales subyacentes a este manuscrito desde el repositorio de datos original de Stowers en http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.
Materials
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/ml) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 ml) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/ml) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
References
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