Fırça hücrelerinin Mouse tracheas 'tan izolasyon ve nicel değerlendirilmesi
Summary
Fırça hücreleri naif fare trakea bulunan nadir kolinerjik kemoduyusal epitelyal hücrelerdir. Sınırlı sayılar nedeniyle, havayolu bağışıklık ve remodeling fonksiyonel rolünün ex vivo değerlendirilmesi zordur. Trakeal fırça hücrelerinin Akış sitometrisi ile yalıtımına yönelik bir yöntem tarif ediyoruz.
Abstract
Trakeal fırça hücreleri, hava yolu lümeninden bağışıklık ve sinir sistemlerine sinyal iletimi için uygulanan kolinerjik kemoduyusal epitelyal hücrelerdir. Onlar bağırsak mukozasında tutam hücreleri, trakea fırça hücreleri ve burun mukozasında soliter kemoduyusal ve mikrovillöz hücreler içeren kemoduyusal epitelyal hücreler ailesinin bir parçasıdır. Farklı epitelyal bölmeler içindeki kemoduyusal hücreler anahtar hücre içi işaretçileri ve çekirdek transkripsiyonel imzayı paylaşır, aynı zamanda önemli transkripsiyonel heterojenliği de gösterir, muhtemelen yerel doku ortamını yansıtırlar. Tek hücreli süspansiyonların trakeal fırça hücrelerinin yalıtımı ayrıntılı olarak bu nadir epitelyal hücrelerin fonksiyonunu tanımlamak için gereklidir, ama onların yalıtım zorlu, potansiyel trakeal fırça hücreleri ve sinir uçları arasındaki yakın etkileşimi nedeniyle veya sıkı ve yapışır kavşak hava yolu özgü bileşimi nedeniyle. Burada, fare trakeal epitelyumdan fırça hücrelerinin yalıtımına yönelik bir prosedür açıklanmaktadır. Yöntem, submukoza gelen trakeal epitel ilk ayrımı dayanmaktadır, papain ile epitelyal levha bir sonraki kısa kuluçarı için izin. Bu prosedür, akış cytometrik sıralama ve uygulanabilir trakeal fırça hücrelerinin fonksiyonel analizi için hızlı ve kullanışlı bir çözüm sunar.
Introduction
Fırça hücreleri, acı tat reseptörlerinin ifadesi ve tat tomurcuğu hücrelerinde bulunan tat reseptörü dönüştürücü makinelerinin karakterize olduğu kemoduyusal epitelyal hücreler sınıfına aittir. Tat tomurcuk hücrelerinin aksine, kemoduyu epitelyal hücreler epitelyal yüzeylerde dağılmış ve burun epiteli hücreler (SCCS) ve microvillous hücreleri olarak adlandırılır1,2, trakea fırça hücreleri 3,4, ve tüft hücreler bağırsak5,6. Acı tat reseptörleri ve acı tat dönüştürücü makine ifade epitelyal hücreler de üretra7,8 ve işitsel tüp9bulunur. Hava yolu fırça hücreleri nörojenik ve bağışıklık havayolu yanıtlarında benzersiz işlevlere sahiptir. Onlar asetilkolin üreten kemoduyusal hücreler, acı bileşikler ve çekirdek algılama maddeleri gibi bakteriyel metabolitler ile aktivasyon üzerine koruyucu solunum refleksleri uyandıran10. Havayolu fırça hücreleri de Il-25 baskın hava yolu epitelyal kaynağıdır, hangi hava yolları3aeroallerjen-elicited tip 2 inflamasyon düzenler.
Alt hava yolu fırça hücrelerinin tam transkriptom karakterizasyonu ve çevresel uyaranlara yanıt onların düşük sayılar trakeal epitelyum ve büyük bronşi10ötesinde çok sınırlı sayıda ile sınırlıdır. Bağırsak epitelinin kemoduyusal hücrelerin izolasyonunda kullanılan teknikler, trakea ‘dan orantılı olarak yüksek sayılar vermedi, muhtemelen sinir uçları ile trakeal fırça hücrelerinin samimi temasları nedeniyle10 veya diğer yapışkanslar ve sıkı kavşak proteinlerinin bileşimi gibi solunum mukozasında dokuya özgü faktörler. Tek hücreli RNA sıralama analizi için daha yüksek sayılarda trakeal fırça hücrelerinin başarılı bir şekilde yalıtılmasının son raporları, papain ile 2 h inkübasyon ya da pronase11,12ile 18 h inkübasyon kullanılmıştır. Sindirim enzimleri ile uzun kuluzlar hücre canlılığı azaltabilir ve sindirilmiş dokulardan hücrelerin transkripsiyonel profilini değiştirmek beri13, bu diğer chemosensory epitelyal nüfusu ile önyargı karşılaştırmalı analiz olabilir.
Burada, RNA sıralaması3için trakeal fırça hücrelerinin yalıtımına yönelik bir yöntem bildiriyoruz. Yüksek doz dispaz ile trakea tedavisi submukoza epitel ayırır. Papain ile epitelyal sac sonraki sindirim Bu yapısal hücrenin mükemmel iyileşme sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz 40 dakika için yüksek doz dispaz tedavisi bir arada kısa papain tedavisi (30 dk) takip, trakeal sindirim ve fırça hücre yalıtımı için optimum bir protokol sağlar bulundu. Bu kombinasyon hem geniş sindirim önler ve fırça hücrelerinin en yüksek verim üretir, alternatif protokollere kıyasla.
Hematopoetik hücreler ayıklamak için akciğer sindirimi klasik kolajenaz IV15gibi hafif sindirim enzimleri üzerinde dayanırken, epitelyal hücrelerin yalıt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Brigham ve kadın ınsan Immünoloji merkezi Flow Core akış cytometrik sıralama ile onun yardımı için adam Chicoine teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık bağışları R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N. A. B), U19 AI095219 (N.A.B., L. G. B) ve K08 AI132723 (L. G. B) ve Amerikan alerji, astım ve Immünoloji (AAAAI)/Amerikan Akciğer alerjisi tarafından destekleniyordu Solunum hastalığı Ödülü (N.A.B.), AAAAI Vakfı fakülte geliştirme Ödülü (L.G.B.) tarafından, Steven ve Judy Kaye genç yenilikçiler Ödülü (N.A.B.) tarafından, JoYcElYn C. Austen Fonu kadın hekim bilim adamları kariyer gelişimi için (L.G.B.), ve bir vinik ailesi (L.G.B.) tarafından cömert bağış.
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) | Abcam | cat# ab5450 | |
| APC anti-mouse CD326 (EpCAM) (G8.8) | Biolegend | cat#118214 | |
| APC Rat IgG2a, k isotype control | Biolegend | cat#400511 | |
| DAPI | Biolegend | cat#422801 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies/Molecular Probes | cat#A-11055 | |
| Normal Goat IgG | R&D Systems | cat#AB-108-C | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) | Biolegend | cat#103126 | |
| Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control | Biolegend | cat#400627 | |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | cat#101320 | |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| Dispase | Gibco | cat# 17105041 | |
| DNase I | Sigma | cat# 10104159001 | |
| HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter | Boston BioProducts | cat# PY-912 | |
| Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) | Boston BioProducts | cat# BSS-355 | |
| L-Cysteine | Sigma | cat# C7352 | |
| Leupeptin trifluoroacetate salt | Sigma | cat# L2023 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | cat# P3125 | |
| Propidium iodide | Sigma | cat# P4170 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) | The Jackson Laboratory | 7902 | |
| Equipment | |||
| LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope | Zeiss | ||
| LSRFortessa | BD | 647465 | |
| Disposable equipment | |||
| 1.5 mL sterile tubes | Thomas Scientific | 1157C86 | |
| 5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 x 75 mm style | Falcon | 14-959-1A | |
| 50 mL Polypropylene conical tube, 30 x 115 mm style | Falcon | 352098 | |
| Feather Disposable Scalpel no.12 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Petri dish, 100 x 15 mm Style | Falcon | 351029 | |
| Sterile cell strainer, 100 μm | Fisherbrand | cat#22363549 |
References
- Tizzano, M., et al. Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).
- Genovese, F., Tizzano, M. Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade. PLoS One. 13 (9), 0202754 (2018).
- Bankova, L. G., et al. The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation. Science Immunology. 3 (28), (2018).
- Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules. Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).
- Nadjsombati, M. S., et al. Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit. Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).
- von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
- Deckmann, K., et al. Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).
- Liu, S., et al. Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues. Frontiers in Physiology. 8, 849 (2017).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube. Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
- Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system. Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
- Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice. Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).
- Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
- Rock, J. R., et al. Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways. Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
- Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets. Frontiers in Pharmacology. 7, 107 (2016).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
- Kaiser, O., et al. Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain. PLoS One. 8 (12), 80490 (2013).
- Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes. Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).
- Kohanski, M. A., et al. Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).
- Patel, N. N., et al. Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps. International Forum of Allergy & Rhinology. , (2018).
- Kouzaki, H., O’Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2. The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).
- Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells. The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).
- Nishikado, H., et al. Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).
