Summary

Isolação e avaliação quantitativa de pilhas da escova dos Tracheas do rato

Published: June 12, 2019
doi:

Summary

As pilhas da escova são pilhas epithelial quimiosensoriais colinérgicos raras encontradas na traquéia ingênua do rato. Devido a seus números limitados, a avaliação ex vivo de seu papel funcional na imunidade e na remodelação da via aérea é desafiante. Nós descrevemos um método para a isolação de pilhas tracheal da escova pelo fluxo cytometry.

Abstract

Células da escova traqueal são células epiteliais quimiosensoriais colinérgicas pronta para transmitir sinais do lúmen das vias aéreas para os sistemas imunológico e nervoso. Eles são parte de uma família de células epiteliais quimiosensoriais que incluem células de tufo na mucosa intestinal, células de pincel na traquéia, e células quimiosensoriais e microvillous solitárias na mucosa nasal. As pilhas de chemosensory em compartimentos epithelial diferentes compartilham dos marcadores intracelular chaves e de uma assinatura transcricional do núcleo, mas igualmente para indicar a heterogeneidade transcricional significativa, reflexivo provável do ambiente local do tecido. A isolação de pilhas tracheal da escova das suspensões da única pilha é exigida para definir a função destas pilhas epithelial raras em detalhe, mas seu isolamento é desafiante, potencial devido à interação próxima entre pilhas da escova e terminações de nervo tracheal ou devido à composição da via aérea específica de junções apertadas e aderens. Aqui, nós descrevemos um procedimento para a isolação de pilhas da escova do epitélio tracheal do rato. O método é baseado em uma separação inicial do epitélio tracheal da submucosa, permitindo uma incubação mais curta subseqüente da folha epithelial com Papain. Este procedimento oferece uma solução rápida e conveniente para a classificação citométrica do fluxo e a análise funcional de pilhas tracheal viáveis da escova.

Introduction

As pilhas da escova pertencem a uma classe de pilhas epithelial quimiossensorial caracterizadas pela expressão de receptores amargos do gosto e da maquinaria do transdução do receptor do gosto encontradas em pilhas do botão do gosto. Ao contrário das pilhas do botão do gosto, as pilhas epithelial quimiossensorial são dispersadas em superfícies epithelial e são referidas como pilhas quimiossensorial solitárias (SCCs) e pilhas microvillous no epitélio nasal1,2, pilhas da escova na traqueia 3,4e células de tufo no intestino5,6. Células epiteliais que expressam receptores de paladar amargo e a máquina de transdução de paladar amargo também são encontradas na uretra7,8 e no tubo auditivo9. As pilhas da escova da via aérea têm funções originais em respostas neurogênica e imunes da via aérea. Eles são células quimiosensoriais produtoras de acetilcolina que evocam reflexos respiratórios protetores após a ativação com compostos amargos e metabólitos bacterianos como substâncias que detectam quorum10. As pilhas da escova da via aérea são igualmente a fonte epithelial dominante da via aérea de IL-25, que regula o tipo aeroalergeno-eliciado-2 inflamação nas vias aéreas3.

A caracterização do transcriptoma completo de células de escova de vias aéreas inferiores e sua resposta a estímulos ambientais tem sido limitada por seus baixos números no epitélio traqueal e números muito limitados além dos grandes brônquios10. As técnicas usadas para o isolamento de células quimiosensoriais do epitélio intestinal não produziram números proporcionalmente altos da traquéia, possivelmente por causa dos contatos íntimos de células da escova traqueal com terminações nervosas10 ou outras fatores tecido-específicos na mucosa respiratória tais como a composição de aderens e de proteínas apertadas da junção. Os relatórios recentes da isolação bem sucedida de pilhas tracheal da escova em números mais elevados para a análise de sequenciamento do RNA da única pilha empregou uma incubação de 2 h com papaína ou uma incubação de 18 h com soros11,12. Uma vez que incubações mais longas com enzimas digestivas podem diminuir a viabilidade celular e alterar o perfil transcricional das células dos tecidos digeridos13, isso poderia viés de análise comparativa com outras populações epiteliais quimiosensoriais.

Aqui, nós relatamos um método para a isolação de pilhas tracheal da escova para arranjar em seqüência3do RNA. O tratamento da traquéia com Dispase da elevado-dose separa o epitélio da submucosa. A digestão subseqüente da folha epithelial com papaína permite a recuperação excelente desta pilha estrutural.

Protocol

Antes de realizar os seguintes experimentos, assegure-se de que todos os protocolos e uso de cuidados com animais sejam aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais (IACUC) e realizado de acordo com o “guia para o cuidado e uso de Animais de laboratório “(8ª edição, 2011) e as orientações chegam. Todos os procedimentos descritos abaixo foram revisados e aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais do hospital Brigham e Women ‘ s. <p class="jov…

Representative Results

Este procedimento foi implementado com sucesso para isolar as células da escova traqueal para sequenciamento de RNA3. Após isolamento da traquéia e digestão do tecido com protocolo de 2 etapas (Figura 1), as células foram coletadas e CORADAS com CD45 e epcam com rótulo fluorescently após exclusão das células mortas com PI. Após o gating para fora doublets baseado em características da dispersão da frente e do lado, nós definimos pilhas da escova como baix…

Discussion

Nós encontramos que uma combinação de tratamento do Dispase da elevado-dose para o minuto 40 seguido por um tratamento curto do papaína (30 minutos) fornece um protocolo óptimo para a digestão tracheal e a isolação da pilha da escova. Esta combinação evita a digestão extensiva e produz o rendimento o mais elevado de pilhas da escova, comparado aos protocolos alternativos.

Enquanto a digestão pulmonar para extrair células hematopoiéticas classicamente se baseou em enzimas digestiv…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Adam Chicoine no núcleo de fluxo do centro de Imunologia humana da Brigham e da mulher por sua ajuda com a triagem citométrica de fluxo. Este trabalho foi apoiado pelos institutos nacionais de bolsas de saúde R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N. A. B), U19 AI095219 (N.A.B., L. G. B), e K08 AI132723 (L. G. B), e pela Academia Americana de alergia, asma e Imunologia (AAAAI)/pulmão americano alérgico Prêmio de doença respiratória (N.A.B.), pelo prêmio de desenvolvimento de professores da Fundação AAAAI (L.G.B.), pelo prêmio Steven e Judy Kaye Young Innovators (N.A.B.), pelo JoYcElYn C. Austen Fund for desenvolvimento de carreira de cientistas de médicos de mulheres (L.G.B.), e por um doação generosa pela família Vinik (L.G.B.).

Materials

Antibodies
Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) Abcam cat# ab5450
APC anti-mouse CD326 (EpCAM)  (G8.8) Biolegend cat#118214
APC Rat IgG2a, k isotype control Biolegend cat#400511
DAPI Biolegend cat#422801
Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Life Technologies/Molecular Probes cat#A-11055
Normal Goat IgG R&D Systems cat#AB-108-C
Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) Biolegend cat#103126
Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control Biolegend cat#400627
TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody Biolegend cat#101320
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
Dispase Gibco cat# 17105041 
DNase I Sigma  cat# 10104159001
HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter Boston BioProducts cat# PY-912
Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) Boston BioProducts cat# BSS-355
L-Cysteine Sigma cat# C7352
Leupeptin trifluoroacetate salt Sigma cat# L2023
Papain from papaya latex Sigma cat# P3125
Propidium iodide  Sigma cat# P4170
Experimental Models: Organisms/Strains
ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) The Jackson Laboratory 7902
Equipment
LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope Zeiss
LSRFortessa BD 647465
Disposable equipment
1.5 mL sterile tubes Thomas Scientific 1157C86
5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 x 75 mm style Falcon 14-959-1A
50 mL Polypropylene conical tube, 30 x 115 mm style Falcon 352098
Feather Disposable Scalpel no.12 Fisher Scientific NC9999403
Petri dish, 100 x 15 mm Style Falcon 351029
Sterile cell strainer, 100 μm Fisherbrand cat#22363549

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Cite This Article
Ualiyeva, S., Yoshimoto, E., Barrett, N. A., Bankova, L. G. Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas. J. Vis. Exp. (148), e59496, doi:10.3791/59496 (2019).

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