Summary

Isolamento e valutazione quantitativa delle celle pennello dalle trachea del topo

Published: June 12, 2019
doi:

Summary

Le cellule pennello sono rare cellule epiteliali colinergiche chesidiche che si trovano nella trachea del topo ingenuo. A causa del loro numero limitato, la valutazione ex vivo del loro ruolo funzionale nell’immunità e nel rimodellamento delle vie aeree è impegnativa. Descriviamo un metodo per l’isolamento delle cellule del pennello tracheale dalla citometria di flusso.

Abstract

Le cellule pennello tracheali sono cellule epiteliali colinergiche pronte a trasmettere segnali dal lume delle vie aeree al sistema immunitario e nervoso. Fanno parte di una famiglia di cellule epiteliali chemiosensoriali che includono cellule del ciuffo nella mucosa intestinale, cellule pennello nella trachea, e cellule chemiosensoriali solitarie e microvillous nella mucosa nasale. Le cellule chemiosensoriali in diversi compartimenti epiteliali condividono marcatori intracellulari chiave e una firma trascrizionale di base, ma mostrano anche una significativa eterogeneità trascrizionale, probabilmente riflettente dell’ambiente del tessuto locale. L’isolamento delle cellule del pennello tracheale dalle sospensioni a cella singola è necessario per definire in dettaglio la funzione di queste rare cellule epiteliali, ma il loro isolamento è impegnativo, potenzialmente a causa della stretta interazione tra le cellule del pennello tracheale e le terminazioni nervose o a causa della composizione specifica delle vie aeree di giunzioni strette e aderenti. Qui, descriviamo una procedura per l’isolamento delle cellule pennello dall’epitelio tracheale del topo. Il metodo si basa su una separazione iniziale dell’epitelio tracheale dalla sottomucosa, consentendo una successiva incubazione più breve del foglio epiteliale con papaina. Questa procedura offre una soluzione rapida e conveniente per lo smistamento citometrico del flusso e l’analisi funzionale delle cellule pennello tracheale vitali.

Introduction

Le cellule pennello appartengono a una classe di cellule epiteliali chemiosensoriali caratterizzate dall’espressione di recettori del gusto amaro e dal meccanismo di trasduzione del recettore del gusto presente nelle cellule delle papille gustative. A differenza delle cellule epiteliali chemiosensoriali, le cellule epiteliali chemiosensoriali sono sparse in superfici epiteliali e sono indicate come cellule chemiosensoriali solitarie (SCC) e cellule microvinili nell’epitelio nasale1,2, cellule pennello nel trachea 3,4, e cellule di ciuffo nell’intestino5,6. Le cellule epiteliali che esprimono recettori del gusto amaro eil meccanismo di trasduzione amara si trovano anche nell’uretra 7,8 e nel tubo uditivo9. Le cellule pennello delle vie aeree hanno funzioni uniche nelle risposte neurogeniche e immunitarie delle vie aeree. Sono cellule chemiosensoriali che producono acetilcolina che evocano riflessi respiratori protettivi dopo l’attivazione con composti amari e metaboliti batterici come sostanze di quorum-sensing10. Le cellule pennello delle vie aeree sono anche la fonte epiteliale delle vie aeree di IL-25, che regola l’infiammazione di tipo 2 aeroallergened nelle vie respiratorie3.

La caratterizzazione del trascrittoma completo delle cellule pennello delle vie aeree inferiori e la loro risposta agli stimoli ambientali è stata limitata dal loro basso numero nell’epitelio tracheale e da un numero molto limitato oltre il grande bronchi10. Le tecniche utilizzate per l’isolamento delle cellule chemiosensoriali dall’epitelio intestinale non hanno prodotto numeri proporzionalmente elevati dalla trachea, probabilmente a causa dei contatti intimi delle cellule pennello tracheale con terminazioni nervose10 o altro fattori specifici del tessuto nella mucosa respiratoria come la composizione di aderesi e proteine di giunzione strette. Recenti rapporti di isolamento riuscito delle cellule pennello tracheale in numero maggiore per l’analisi di sequenziamento di RNA a singola cellula hanno impiegato un’incubazione di 2 h con papaina o un’incubazione di 18 h con prosiano11,12. Poiché incubazioni più lunghe con enzimi digestivi possono diminuire la vitalità cellulare e alterare il profilo trascrizionale delle cellule dai tessuti digeriti13, questo potrebbe bias comparativa analisi con altre popolazioni epiteliali chemiosensoriali.

Qui, segnaliamo un metodo per l’isolamento delle cellule del pennello tracheale per il sequenziamento dell’RNA3. Il trattamento della trachea con dispase ad alto dosaggio separa l’epitelio dalla submucosa. La successiva digestione del foglio epiteliale con papaina consente un eccellente recupero di questa cellula strutturale.

Protocol

Prima di condurre i seguenti esperimenti, assicurarsi che tutti gli usi e i protocolli per la cura degli animali siano approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) e siano eseguiti in accordo con la “Guida per la cura e l’uso di Laboratory Animals” (8a edizione 2011) e le linee guida DI ARRIVE. Tutte le procedure descritte di seguito sono state riviste e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali presso il Brigham and Women’s Hospital. <p …

Representative Results

Questa procedura è stata implementata con successo per isolare le cellule del pennello tracheale per il sequenziamento dell’RNA3. Dopo l’isolamento della trachea e la digestione del tessuto con un protocollo in 2 fasi (Figura 1), le cellule sono state raccolte e macchiate con CD45 ed EpCAM con etichettaflua fluorescente dopo l’esclusione delle cellule morte con PI. Dopo aver creato doppietti in base alle caratteristiche di dispersione in avanti e laterale, abbiamo de…

Discussion

Abbiamo scoperto che una combinazione di trattamento dispase ad alta dose per 40 min seguita da un breve trattamento papaina (30 min) fornisce un protocollo ottimale per la digestione tracheale e l’isolamento delle cellule pennello. Questa combinazione evita una digestione estesa e produce la massima resa di celle pennello, rispetto ai protocolli alternativi.

Mentre la digestione polmonare per estrarre le cellule ematopoietiche ha classicamente invocato enzimi digestivi lievi come collagenae I…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Adam Chicoine al Brigham and Women’s Human Immunology Center Flow Core per il suo aiuto con lo smistamento citometrico del flusso. Questo lavoro è stato supportato da National Institutes of Health Grants R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B), U19 AI095219 (N.A.B., L.G.B), e K08 AI132723 (L.G.B), e dall’American Academy of Allergy, Asthma, and Immunology (AAAAI)/ American Lung Allergic Respiratory Disease Award (N.A.B.), del Premio AAAAI Foundation Faculty Development Award (L.G.B.), dello Steven and Judy Kaye Young Innovators Award (N.A.B.), del Joycelyn C. Austen Fund for Career Development of Women Physician Scientists (L.G.B.), e di un generosa donazione da parte della famiglia Vinik (L.G.B.).

Materials

Antibodies
Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) Abcam cat# ab5450
APC anti-mouse CD326 (EpCAM)  (G8.8) Biolegend cat#118214
APC Rat IgG2a, k isotype control Biolegend cat#400511
DAPI Biolegend cat#422801
Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Life Technologies/Molecular Probes cat#A-11055
Normal Goat IgG R&D Systems cat#AB-108-C
Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) Biolegend cat#103126
Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control Biolegend cat#400627
TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody Biolegend cat#101320
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
Dispase Gibco cat# 17105041 
DNase I Sigma  cat# 10104159001
HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter Boston BioProducts cat# PY-912
Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) Boston BioProducts cat# BSS-355
L-Cysteine Sigma cat# C7352
Leupeptin trifluoroacetate salt Sigma cat# L2023
Papain from papaya latex Sigma cat# P3125
Propidium iodide  Sigma cat# P4170
Experimental Models: Organisms/Strains
ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) The Jackson Laboratory 7902
Equipment
LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope Zeiss
LSRFortessa BD 647465
Disposable equipment
1.5 mL sterile tubes Thomas Scientific 1157C86
5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 x 75 mm style Falcon 14-959-1A
50 mL Polypropylene conical tube, 30 x 115 mm style Falcon 352098
Feather Disposable Scalpel no.12 Fisher Scientific NC9999403
Petri dish, 100 x 15 mm Style Falcon 351029
Sterile cell strainer, 100 μm Fisherbrand cat#22363549

References

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Cite This Article
Ualiyeva, S., Yoshimoto, E., Barrett, N. A., Bankova, L. G. Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas. J. Vis. Exp. (148), e59496, doi:10.3791/59496 (2019).

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