Procesamiento de imagen protocolo para el análisis de la difusión y del tamaño del clúster de receptores de membrana por microscopía de fluorescencia
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la sola partícula seguimiento análisis de imagen que permite la evaluación cuantitativa de los coeficientes de difusión, tipos de movimiento y racimo de tamaños de partículas solo detectados por microscopía de fluorescencia.
Abstract
Rastreo en una secuencia de vídeo y el posterior análisis de sus trayectorias de partículas hoy en día es una operación común en muchos estudios biológicos. Usando el análisis del receptor de membrana de la célula de clusters como un modelo, presentamos un protocolo detallado para esta tarea de análisis de imagen con Fiji (ImageJ) y rutinas Matlab para: 1) definir regiones de interés y diseñar máscaras adaptadas a estas regiones; 2) rastrear las partículas en los videos de la microscopia de fluorescencia; 3) analizar las características de difusión y la intensidad de las pistas. El análisis cuantitativo de los coeficientes de difusión, tipos de movimiento y el tamaño de cluster obtenida por microscopía de fluorescencia y procesamiento de imágenes proporciona una herramienta valiosa para determinar objetivamente la dinámica de la partícula y las consecuencias de la modificación de condiciones ambientales. En este artículo presentamos protocolos detallados para el análisis de estas características. El método descrito aquí no sólo permite la detección de una sola molécula de seguimiento, pero también automatiza la estimación de los parámetros de difusión lateral en la membrana celular, clasifica el tipo de trayectoria y permite análisis completo superando así la dificultades para cuantificar el tamaño de punto durante su trayectoria entera en la membrana celular.
Introduction
Proteínas de la membrana incrustadas en la bicapa lipídica están en continuo movimiento debido a la difusión térmica. Sus dinámicas son esenciales para regular las respuestas celular, Interacciones intermoleculares permiten la formación de complejos que varían en tamaño desde monómeros oligómeros e influir en la estabilidad de complejos de señalización. Elucidar los mecanismos que controlan la dinámica de la proteína es así un nuevo reto en la biología de la célula, necesario para entender las vías de transducción de señal y para identificar funciones imprevistas.
Se han desarrollado algunos métodos ópticos para el estudio de estas interacciones en la vida de las células1. Entre estos, microscopía de fluorescencia (TIRF) de reflexión interna total, desarrollado en la década de 1980, permite el estudio de las interacciones moleculares en o muy cerca de la membrana de la célula2. Para estudiar los parámetros dinámicos de las trayectorias de la proteína de membrana obtenidas de TIRF datos en células vivas, se requiere una sola partícula (SPT) del método de seguimiento. Aunque para esto existen varios algoritmos, utilizamos actualmente las publicadas por Jaqaman et al.3 dirección heterogeneidad del movimiento de partículas en un campo de partículas densas uniendo partículas entre fotogramas consecutivos para conectar la pista resultante segmentos en trayectorias completadas (desaparición de partículas temporales). El software captura la partícula combinar y dividir ese resultado de agregación y disociación de eventos3. Uno de los datos de salida de este software es la detección de las partículas a lo largo de la trayectoria entera definiendo sus posiciones X e Y en cada fotograma.
Una vez que las partículas se detectan, se aplican diferentes algoritmos para determinar el intervalo corto difusión coeficiente (D1-4)4,5. Aplicando el análisis de espectro de escalamiento de momento (MSS)6,7,8 o ajustando el valor de ‘alpha’ por ajuste de desplazamiento cuadrático medio (MSD) a la curva9, también clasificar las partículas según el tipo de trayectoria.
Análisis de intensidad de la mancha en imágenes de fluorescencia es un objetivo compartido por los científicos en el campo10,11. El algoritmo más común utilizado es el número llamado y el brillo. Este método, sin embargo, no permite detección de correcta intensidad del cuadro a cuadro en las partículas en la fracción móvil. Así, hemos generado un nuevo algoritmo para evaluar estas partículas intensidades fotograma por fotograma y para determinar su estado de agregación. Una vez que las coordenadas de cada partícula se detectan utilizando U-Track2 software3, definimos su intensidad en cada fotograma sobre la trayectoria completa, teniendo en cuenta también el fondo de la celda en cada fotograma. Este software ofrece diferentes posibilidades para determinar la intensidad de la mancha y el fondo de la célula y utilizando proteínas monoméricas y dimérica conocidas como referencias, calcula el número aproximado de proteínas en la partícula detectada (tamaño del clúster).
En este artículo, describimos una guía cuidadosa para realizar estos tres pasos: 1) detección y seguimiento de las partículas individuales a lo largo de un vídeo de la microscopia de fluorescencia utilizando U-; 2) analizando el coeficiente de difusión instantánea (D1-4) de las partículas y el tipo de movimiento (confinado, libre o dirigido) de partículas con trayectorias largas por SMS; 3) medición de la intensidad de la mancha a lo largo del video corregido por la fluorescencia de fondo estimado para cada punto. Esto permite la estimación del tamaño de racimo y la identificación de los pasos de fotoblanqueo.
El uso de este Protocolo no requiere habilidades especializadas y se puede realizar en cualquier laboratorio con cultivo celular, servicios de microscopia y citometría de flujo. El protocolo utiliza ImageJ o Fiji (una distribución de ImageJ12), U-track3y algunas rutinas de hoc hecho ad (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). Rutinas U-track y ad hoc funcionan sobre Matlab que puede instalarse en cualquier computadora compatible.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método descrito es fácil de realizar incluso sin tener experiencia previa trabajando con Matlab. Sin embargo, las rutinas de Matlab extremadamente requieren exactitud con la nomenclatura de los diferentes comandos y la localización de las diferentes carpetas empleados por el programa. En el seguimiento de rutina de análisis (paso 3), pueden modificarse varios parámetros. La ventana de “Configuración gaussiana-mezcla modelo montaje” (paso 3.8) controla cómo U-track detecta partículas individuales en el video. E…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos agradecidos a Carlo Manzo y Maria García Parajo por su ayuda y código fuente de los análisis de coeficiente de difusión. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Ministerio de ciencia, innovación y universidades (SAF 2017-82940-R) y el programa RETICS del Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 y RD16/0012/0006; RIER). LMM y JV son apoyadas por el programa COMFUTURO de la Fundación General CSIC.
Materials
| Human Jurkat cells | ATCC | CRL-10915 | Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software |
| pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP | Clontech | 632469 | Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine |
| Gene Pulse X Cell electroporator | BioRad | We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells. Use the transfection method best working in your hands. | |
| Cytomics FC 500 flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required. You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest. | |
| Dako Qifikit | DakoCytomation | K0078 | Used for quantification the number of receptors in the cell surface. |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek corporation | P35G-1.5-10-C | |
| Human Fibronectin from plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Recombinant human CXCL12 | PeproTech | 300928A | |
| Inverted Leica AM TIRF | Leica | ||
| EM-CCD camera | Andor | DU 885-CSO-#10-VP | |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | ||
| U-Track2 software | Danuser Laboratory | ||
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| FiJi | FiJI | https://imagej.net/Fiji) | |
| u-Track2 software | Matlab tool. For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice | ||
| GraphPad Prism | GraphPad software |
References
- Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
- Bakker, G. J., et al. Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).
- Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).
- Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. Strongly and weakly self-similar diffusion. Physica D. 154, 111-137 (2001).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).
- Ewers, H., et al. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).
- Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).
- Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).
- Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Martinez-Munoz, L., et al. Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function. Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).
- Destainville, N., Salome, L. Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments. Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).
