Traitement d’image protocole pour l’analyse de la Diffusion et la taille de Cluster de récepteurs membranaires par microscopie de Fluorescence
Summary
Nous présentons ici un protocole pour une seule particule suivi d’analyse d’images qui permet une évaluation quantitative des coefficients de diffusion, types de tailles de motion et cluster de simples particules détectées par microscopie à fluorescence.
Abstract
Suivi sur une séquence vidéo et de l’analyse postérieure de leurs trajectoires de particules est aujourd’hui une opération courante dans de nombreuses études biologiques. À l’aide de l’analyse des récepteurs de la membrane cellulaire des grappes comme modèle, nous présentons un protocole détaillé pour cette tâche d’analyse image à l’aide de Fidji (ImageJ) et routines Matlab pour : 1) définir des zones d’intérêt et de concevoir des masques adaptés à ces régions ; 2) suivre les particules dans les vidéos de microscopie de fluorescence ; 3) analyser les caractéristiques de diffusion et de l’intensité des titres sélectionnés. L’analyse quantitative des coefficients de diffusion, les types de mouvement et la taille de cluster obtenues en microscopie par fluorescence et de traitement d’image fournit un outil précieux pour déterminer objectivement la dynamique des particules et les conséquences de la modification conditions environnementales. Dans cet article, nous présentons des protocoles détaillés pour l’analyse de ces fonctionnalités. La méthode décrite ici non seulement permet la détection de molécules simples suivi, mais automatise également l’estimation des paramètres de diffusion latérale à la membrane cellulaire, classifie le type de trajectoire et permet une analyse complète ainsi surmonter la difficultés pour quantifier la taille du spot sur sa trajectoire entière à la membrane cellulaire.
Introduction
Protéines de la membrane intégrées dans la bicouche lipidique sont en mouvement continu en raison de la diffusion thermique. Leur dynamique est essentielle pour réguler les réactions de cellules, comme les interactions intermoléculaires permettent la formation de complexes qui varient en taille de monomères d’oligomères et influencent la stabilité des complexes de signalisation. Élucider les mécanismes qui contrôlent la dynamique des protéines est donc un nouveau défi en biologie cellulaire, nécessaire pour comprendre les voies de transduction de signal et d’identifier les fonctions des cellules imprévus.
Certaines méthodes optiques ont été développées pour étudier ces interactions dans la vie des cellules1. Parmi ceux-ci, microscopie à fluorescence (FRBR) réflexion totale interne, mis au point dans les années 1980, permet l’étude des interactions moléculaires à ou très près de la membrane de la cellule2. Afin d’étudier les paramètres dynamiques des trajectoires de protéine de membrane FRBR données dans les cellules vivantes, il faut une seule particule suivi méthode (SPT). Bien que plusieurs algorithmes sont disponibles pour cela, nous utilisons actuellement celles publiées par Jaqaman et al.3 qui abordent l’hétérogénéité de mouvement de particules dans un champ de particules denses en liant les particules entre images consécutives pour relier la piste qui en résulte segments en trajectoires complets (disparition temporaire de particules). Le logiciel capture la particule qui résulte de l’agrégation et la dissociation des événements3de fractionnement et fusion. Parmi les données de sortie de ce logiciel est détection des particules le long de la trajectoire toute en définissant leurs positions X et Y dans chaque image.
Une fois que les particules sont détectés, nous appliquons différents algorithmes pour déterminer le décalage court diffusion coefficient (D1-4)4,5. En appliquant l’analyse du spectre de mise à l’échelle de Moment (MSS)6,7,8 , ou en ajustant la valeur « alpha » par un ajustement de la déplacement quadratique moyenne (TMS) à la courbe9, nous avons également classer les particules selon le type de trajectoire.
Analyse d’intensité spot en images de fluorescence est un objectif commun pour les scientifiques dans le domaine10,11. L’algorithme couramment utilisé est la soi-disant numéro et la luminosité. Cette méthode néanmoins ne permet pas bonne intensité d’image par image détection de particules dans la fraction mobile. Nous avons, par conséquent, généré un nouvel algorithme d’évaluer ces particules intensités image par image et de déterminer leur état d’agrégation. Une fois que les coordonnées de chaque particule sont détectées à l’aide de logiciel U-Track23, nous définissons son intensité dans chaque image sur la trajectoire complète, compte tenu également de l’arrière-plan de la cellule dans chaque image. Ce logiciel offre différentes possibilités afin de déterminer l’intensité du spot et l’arrière-plan de la cellule et, à l’aide de protéines monomériques et dimériques connues comme références, calcule le nombre approximatif des protéines dans la particule détectés (taille de cluster).
Dans cet article, nous décrivons un guide attentif pour effectuer ces trois étapes : 1) détecter et suivre des particules seul le long d’une vidéo de microscopie de fluorescence à l’aide de rail-U ; 2) analysant le coefficient de diffusion instantanée (D1-4) de ces particules et le type de mouvement (clos, libre ou dirigée) des particules avec longues trajectoires par MSS ; 3) mesure de l’intensité de tache le long de la vidéo corrigée par la fluorescence de fond estimée pour chaque tache. Cela permet l’estimation de taille de cluster et l’identification des étapes Photoblanchiment.
L’utilisation du présent protocole ne nécessite pas de compétences spécialisées et peut être effectuée dans n’importe quel laboratoire de culture cellulaire, flow cytometry et microscopie des installations. Le protocole utilise ImageJ ou Fidji (une distribution de ImageJ12), U-piste3et des routines de hoc fait ad (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-track et ad hoc routines écrasé de Matlab qui peut être installé dans n’importe quel ordinateur compatible.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite est facile à réaliser, même sans avoir aucune expérience antérieure de travail avec Matlab. Toutefois, les routines Matlab exigent extrêmement précision avec la nomenclature des différentes commandes et la localisation des différents dossiers utilisés par le programme. Dans le suivi routine d’analyse (étape 3), plusieurs paramètres peuvent être modifiés. La fenêtre « Réglage mélange gaussien modèle convenable » (étape 3,8) contrôle comment U-track permet de détecter des par…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à Carlo Manzo et Maria García Parajo pour leur aide et le code source de l’analyse de coefficient de diffusion. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du ministère espagnol de la Science, l’Innovation et des universités (SAF 2017-82940-R) et le programme RETICS de l’Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 et RD16/0012/0006 ; RIER). LMM et JV sont pris en charge par le programme COMFUTURO de la Fundación General CSIC.
Materials
| Human Jurkat cells | ATCC | CRL-10915 | Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software |
| pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP | Clontech | 632469 | Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine |
| Gene Pulse X Cell electroporator | BioRad | We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells. Use the transfection method best working in your hands. | |
| Cytomics FC 500 flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required. You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest. | |
| Dako Qifikit | DakoCytomation | K0078 | Used for quantification the number of receptors in the cell surface. |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek corporation | P35G-1.5-10-C | |
| Human Fibronectin from plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Recombinant human CXCL12 | PeproTech | 300928A | |
| Inverted Leica AM TIRF | Leica | ||
| EM-CCD camera | Andor | DU 885-CSO-#10-VP | |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | ||
| U-Track2 software | Danuser Laboratory | ||
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| FiJi | FiJI | https://imagej.net/Fiji) | |
| u-Track2 software | Matlab tool. For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice | ||
| GraphPad Prism | GraphPad software |
References
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