画像処理プロトコル、拡散の解析と蛍光顕微鏡による膜受容体のクラスター サイズ
Summary
ここでは、単一粒子の拡散係数、蛍光顕微鏡で検出する単一粒子の運動とクラスター サイズの種類の定量評価ができる画像解析を追跡するためのプロトコルを提案する.
Abstract
粒子追跡ビデオ シーケンスとそれらの軌道の事後解析では、今日多くの生物学研究の一般的な操作です。細胞膜受容体の解析を使用してクラスター モデルが、フィジー (ImageJ) および Matlab ルーチンを使用してこの画像解析タスクの詳細なプロトコルを提案する: 1) 関心領域を定義し、これらの地域に適応したマスクをデザイン2) 蛍光顕微鏡動画内の粒子を追跡します。3) 選択したトラックの拡散と強度特性を解析する.拡散係数の定量的解析、モーション、およびクラスター サイズの型を用いて蛍光顕微鏡と画像処理が粒子のダイナミクスと変更の結果を客観的に判断するための貴重なツールを提供します環境条件。この記事ではこれらの機能の解析のための詳しいプロトコルを提案する.説明する方法ここでだけでなく単一分子追跡検出が細胞膜で横方向の拡散パラメーターの推定の自動化にも、軌道の種類を分類でき、したがって克服する完全な分析、細胞膜でその全体の軌道上のスポット サイズを定量化の難しさ。
Introduction
脂質二重膜に埋め込まれる膜タンパク質は、熱拡散のための連続的な動きにあります。そのダイナミクスは、分子間相互作用は、オリゴマー、モノマーからサイズが異なります、シグナリング複合体の安定性に影響を与える複合体の形成を許可する細胞応答を調整することが不可欠。細胞生物学、シグナル伝達経路を理解し、予期しない細胞機能を識別するために必要な新たな挑戦は、蛋白質ダイナミクスの制御機構の解明。
いくつかの光学的手法が開発されている細胞1生活のこれらの相互作用を研究します。これらのうち、全内部反射蛍光 (TIRF) 顕微鏡、1980 年代初頭に開発によりでまたは非常に近い細胞膜2分子間相互作用の研究ができます。細胞内の全反射データから得られる膜タンパク質軌道の動的パラメーターを研究、単一粒子追跡法 (SPT) が必要です。いくつかのアルゴリズムがこれを利用可能な我々 は現在結果のトラックを接続するための連続するフレーム間の粒子をリンクすることにより密な粒子フィールドの粒子運動の不均質性をアドレス Jaqaman ら3の発行するものを使用します。完全な軌道 (一時粒子消失) にセグメント。ソフトウェア キャプチャ粒子凝集・解離のイベント3からその結果を分割します。このソフトウェアの出力データの 1 つは、各フレーム内の X と Y の位置を定義することによって全体の軌道に沿って粒子の検出です。
粒子が検出されると、我々 は短い兼ねた拡散係数 (D1-4)4,5を決定するさまざまなアルゴリズムを適用します。よると粒子も瞬間スケーリング スペクトル (MSS)6,7,8解析を適用することによって、または調整曲線9平均二乗変位 (MSD) の ‘アルファ’ 値を当てはめによる分類します。軌道の種類。
蛍光画像でスポットの強度の分析は、フィールド10,11の科学者の共通の目的です。使用される最も一般的なアルゴリズムは、いわゆる数と明るさです。このメソッドそれにもかかわらずモバイル画分中の粒子の正しいフレームで強度の検出をできませんは。我々 はしたがって、これら粒子の強度によってフレームを評価して、凝集状態を決定する新しいアルゴリズムを生成しています。U Track2 ソフトウェア3を使用して、各粒子の座標を検出、一度定義その強度各フレームで完全な軌跡を各フレームでセルの背景を考慮します。このソフトウェアは、スポットの強度とセルの背景色を決定するさまざまな可能性を提供していて、粒子の検出 (クラスター サイズ) で蛋白質のおおよその数を計算します、参照として知られている単量体および二量体のタンパク質を使用します。
この資料で述べるこれらの 3 つの手順を実行する注意ガイド: 1) の検出と U-トラックを使用して蛍光顕微鏡のビデオに沿って 1 つの粒子を追跡2) 分析瞬時拡散係数 (D1-4) それらの粒子と MSS; による長い軌道で粒子の運動 (閉じ込められ、無料、フリー、または監督) の種類3) 各スポットに推定される背景の蛍光性によって修正ビデオに沿ってスポットの強度を測定しました。これは、クラスター サイズの推定とフォトブリーチを行なった手順を識別できます。
このプロトコルの使用特別なスキルを必要としない研究室では細胞培養を行うことが、フローサイトメトリー、顕微鏡設備の流れ。プロトコルは、ImageJ やフィジー (ImageJ12分布)、U トラック3、いくつかの広告を作ったホック ルーチン (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip) を使用します。U トラックおよびアドホック ルーチンは、任意の互換性のあるコンピューターにインストールすることができます Matlab 上実行します。
Protocol
Representative Results
Discussion
この方法は、Matlab の使用経験がなくても実行する簡単です。しかし、Matlab ルーチンは非常に、さまざまなコマンドの名称とプログラムで採用されている別のフォルダーのローカライズ精度必要があります。追跡解析ルーチン (ステップ 3)、複数のパラメーターを変更することができます。「設定ガウス混合物モデルふさわしい」ウィンドウ (手順 3.8) U トラックがビデオの単一粒子を検出す?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 は拡散係数解析のヘルプとソース コード カルロ Manzo とマリア ・ ガルシア ・ Parajo に感謝しています。この作品は一部スペイン語科学省、イノベーションや大学 (SAF 2017-82940-R) からの助成金によって支えられた、セルバンテス ・ デ ・ サラッド カルロス 3 世 (RD12/0009/009 と RD16/0012/0006; の RETICS プログラムRIER)。LMM との JV は、フンダシオン一般 CSIC の COMFUTURO プログラムによってサポートされます。
Materials
| Human Jurkat cells | ATCC | CRL-10915 | Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software |
| pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP | Clontech | 632469 | Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine |
| Gene Pulse X Cell electroporator | BioRad | We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells. Use the transfection method best working in your hands. | |
| Cytomics FC 500 flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required. You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest. | |
| Dako Qifikit | DakoCytomation | K0078 | Used for quantification the number of receptors in the cell surface. |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek corporation | P35G-1.5-10-C | |
| Human Fibronectin from plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Recombinant human CXCL12 | PeproTech | 300928A | |
| Inverted Leica AM TIRF | Leica | ||
| EM-CCD camera | Andor | DU 885-CSO-#10-VP | |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | ||
| U-Track2 software | Danuser Laboratory | ||
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| FiJi | FiJI | https://imagej.net/Fiji) | |
| u-Track2 software | Matlab tool. For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice | ||
| GraphPad Prism | GraphPad software |
References
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