Bildverarbeitungs-Protokoll für die Analyse der Diffusion und Cluster-Größe von Membranrezeptoren durch Fluoreszenz-Mikroskopie
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die einzelnen Partikels tracking Bildanalyse, die quantitative Bewertung des Diffusionskoeffizienten, Arten von Bewegung und Cluster-Größen der einzelnen Partikel erkannt durch Fluoreszenz-Mikroskopie ermöglicht.
Abstract
Particle tracking auf einer Videosequenz und die hinteren Analyse ihre Flugbahnen ist heutzutage ein häufiger Vorgang in vielen biologischen Studien. Mit der Analyse der Zellmembran Rezeptor-Cluster als Modell, präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für dieses Bild Analyseaufgabe Fidschi (ImageJ) und Matlab Routinen zu verwenden: 1) Regionen von Interesse zu definieren und gestalten Masken angepasst auf diese Regionen; (2) die Partikel in Fluoreszenz-Mikroskopie-Videos zu verfolgen; (3) Analyse der Verbreitung und Intensität Eigenschaften der ausgewählten Stücke. Die Quantitative Analyse der die Diffusionskoeffizienten, Arten von Bewegung und Cluster-Größe durch Fluoreszenz-Mikroskopie und Bildverarbeitung bietet ein wertvolles Werkzeug, um Partikel Dynamik und die Folgen einer Änderung Objektiv zu bestimmen Umweltbedingungen. In diesem Artikel präsentieren wir ausführliche Protokolle für die Analyse dieser Funktionen. Die beschriebene Methode hier können nicht nur Einzelmolekül-Tracking-Erkennung, aber auch automatisiert die Schätzung der lateralen Diffusion Parameter an der Zellmembran, klassifiziert den Typ der Flugbahn und ermöglicht die vollständige Analyse so überwinden die Schwierigkeiten bei der Quantifizierung der Punktgröße in seiner gesamten Flugbahn an der Zellmembran.
Introduction
Membranproteine in der Lipid-Bilayer eingebettet sind in kontinuierlicher Bewegung durch thermische Diffusion. Ihre Dynamik sind für Zell-Reaktionen zu regulieren wie intermolekulare Wechselwirkungen Bildung von komplexen, die variieren in der Größe von Monomeren, Oligomeren und beeinflussen die Stabilität erlauben der komplexe Signalisierung. Aufklärung der Mechanismen, die Steuerung von Proteindynamik ist somit eine neue Herausforderung in der Zellbiologie, notwendig, Transduktion Signalwege zu verstehen und unerwartete Zellfunktionen zu identifizieren.
Einige optische Methoden zu studieren diese Interaktionen in lebenden Zellen1. Unter diesen ermöglicht Totalreflexion (TIRF) Fluoreszenzmikroskopie, entwickelt in den frühen 1980er Jahren die Untersuchung der molekularen Wechselwirkungen an oder sehr nahe der Zellmembran2. Um dynamische Parameter der Membrane Protein Trajektorien gewonnenen TIRF Daten in lebenden Zellen zu untersuchen, ist ein einzelnes Teilchen tracking-Methode (SPT) erforderlich. Obwohl mehrere Algorithmen dafür zur Verfügung stehen, verwenden wir derzeit von Jaqaman Et Al.3 , die Partikel Bewegung Heterogenität in einem dichten Partikel Feld Adresse durch die Verknüpfung von Teilchen zwischen den aufeinander folgenden Frames, die daraus resultierende Strecke verbinden Segmente in komplette Trajektorien (temporäre Teilchen verschwinden). Die Software erfasst das Teilchen zusammenführen und teilen, die sich aus der Aggregation und Dissoziation Veranstaltungen3. Die Ausgabedaten dieser Software gehört Erkennung der Partikel entlang der gesamten Flugbahn durch die Festlegung ihrer X und Y Positionen in jedem Frame.
Sobald Partikel erkannt werden, wenden wir verschiedene Algorithmen, um die kurze Spanne Diffusion-Koeffizient (D1-4)4,5zu bestimmen. Durch Anwendung der Moment Skalierung Spektrum (MSS)6,7,8 Analyse oder durch den Einbau des ‘Alpha’-Wert durch Anpassung der mittlere quadratische Verschiebung (MSD) auf der Kurve9klassifizieren wir auch die Partikel der Typ der Flugbahn.
Analyse der spot Intensität in Fluoreszenzbilder ist ein gemeinsames Ziel für Wissenschaftler im Bereich10,11. Der am häufigsten verwendete Algorithmus ist die so genannte Zahl und Helligkeit. Diese Methode erlaubt dennoch keine richtige Frame-by-Frame-Intensität-Erkennung in Teilchen in der mobilen Fraktion. Wir haben, so einen neuen Algorithmus, diese Teilchen Intensitäten Frame-by-Frame zu bewerten und zu bestimmen, deren Aggregatzustand erzeugt. Sobald die Koordinaten jedes Partikels mit U-Track2 Software3erkannt werden, definieren wir ihre Intensität in jedem Frame über die gesamte Flugbahn, auch unter Berücksichtigung der Hintergrund der Zelle in jedem Frame. Diese Software bietet verschiedene Möglichkeiten, die vor Ort Intensität und der Hintergrund der Zelle bestimmen und mit bekannten Monomeren und dimeres Proteine als Referenzen, die ungefähre Anzahl der Proteine in der Partikel erkannt (Clustergröße) berechnet.
In diesem Artikel beschreiben wir eine sorgfältige Anleitung um diese drei Schritte ausführen: 1) Erkennung und Verfolgung einzelner Partikel entlang ein Video von Fluoreszenz-Mikroskopie mit U-Track; (2) Analyse der momentanen Diffusionskoeffizienten (D1-4) von diesen Teilchen und die Art der Bewegung (geschlossenen, frei oder gerichtet) Partikel mit lange Flugbahnen von MSS; (3) Messung der vor Ort Intensität entlang der Video korrigiert, indem die geschätzten Hintergrundfluoreszenz für jeden Fleck. Dadurch können Cluster Größe Schätzung und Ermittlung von Immunofluoreszenz-Schritte.
Die Verwendung dieses Protokolls erfordert keine spezielle Fähigkeiten und kann in jedem Labor mit Zellkulturen durchgeführt werden, fließen Cytometry und Mikroskopie Einrichtungen. Das Protokoll verwendet ImageJ oder Fidschi (eine Verteilung von ImageJ-12), U-Track3und einige Ad-Hoc gemacht-Routinen (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-Track und ad-hoc-Routinen Überfahren von Matlab, die in jedem kompatiblen Computer installieren kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das beschriebene Verfahren ist einfach durchzuführen, auch ohne Vorkenntnisse, die Arbeit mit Matlab. Matlab-Routinen erfordern jedoch extrem Genauigkeit mit der Nomenklatur der verschiedenen Befehle und die Lokalisation der verschiedenen Ordner das Programm angestellt. In der Überwachungsdatenbank Analyse-Routine (Schritt 3), mehrere Parameter können geändert werden. Das Fenster “Einstellung passend Gauß-Mischung-Modell” (Schritt 3,8) steuert, wie U-Track einzelne Partikel auf dem Video zu erkennen. Dies geschieht …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar, dass Carlo Manzo und Maria García Parajo für ihre Hilfe und Quell-Code der Diffusion Koeffizient Analyse. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch Zuschüsse vom spanischen Ministerium für Wissenschaft, Innovation und Universitäten (SAF 2017-82940-R) und die RETICS-Programm des Instituto de Salud Carlos III (RD12/0009/009 und RD16/0012/0006; RIER). LMM und JV unterstützt das COMFUTURO-Programm von der Fundación General CSIC.
Materials
| Human Jurkat cells | ATCC | CRL-10915 | Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software |
| pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP | Clontech | 632469 | Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine |
| Gene Pulse X Cell electroporator | BioRad | We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells. Use the transfection method best working in your hands. | |
| Cytomics FC 500 flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required. You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest. | |
| Dako Qifikit | DakoCytomation | K0078 | Used for quantification the number of receptors in the cell surface. |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek corporation | P35G-1.5-10-C | |
| Human Fibronectin from plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Recombinant human CXCL12 | PeproTech | 300928A | |
| Inverted Leica AM TIRF | Leica | ||
| EM-CCD camera | Andor | DU 885-CSO-#10-VP | |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | ||
| U-Track2 software | Danuser Laboratory | ||
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| FiJi | FiJI | https://imagej.net/Fiji) | |
| u-Track2 software | Matlab tool. For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice | ||
| GraphPad Prism | GraphPad software |
References
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