معالجة البروتوكول لتحليل نشر وحجم الكتلة من مستقبلات الغشاء بالفحص المجهري Fluorescence الصور
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا للجسيمات واحدة تتبع تحليل الصور التي تتيح التقييم الكمي لنشر معاملات، أنواع الحركة والكتلة أحجام الجسيمات واحد الكشف عنها بواسطة الفحص المجهري الأسفار.
Abstract
الجسيمات التي تتبع في تسلسل فيديو والتحليل اللاحق لمساراتها في الوقت الحاضر بعملية مشتركة في العديد من الدراسات البيولوجية. تحليل مستقبلات غشاء الخلية باستخدام مجموعات كنموذج، ونحن في الوقت الحاضر بروتوكول مفصل لهذه المهمة تحليل الصور باستخدام فيجي (إيماجيج) وإجراءات Matlab ل: 1) تحديد المناطق ذات الاهتمام وتصميم أقنعة تتكيف مع هذه المناطق؛ 2) تتبع الجسيمات في الأسفار مجهرية أشرطة الفيديو؛ 3) تحليل خصائص انتشار وشدة من المسارات المحددة. التحليل الكمي لمعاملات نشر، أنواع الحركة، وحجم الكتلة التي حصلت عليها مجهرية الأسفار ومعالجة الصور ويوفر أداة قيمة لتحديد موضوعيا ديناميات الجسيمات والمترتبة على تعديل الظروف البيئية. في هذا المقال نقدم بروتوكولات مفصلة لتحليل هذه الميزات. الطريقة الموضحة هنا ليس فقط يسمح الكشف عن تتبع جزيء واحد، ولكن أيضا أتمتة تقدير معلمات الانتشار الأفقي في غشاء الخلية ويصنف نوع مسار ويسمح تحليل كامل وبالتالي التغلب على الصعوبات في قياس حجم بقعة على مساره الكامل في غشاء الخلية.
Introduction
بروتينات الغشاء جزءا لا يتجزأ من بلير الدهن في حركة مستمرة بسبب نشر الحرارية. ديناميتها ضرورية لتنظيم استجابات الخلية، كما جزيئية تسمح تشكيل المجمعات التي تختلف في الحجم من مونومرات إلى ليغومرات وتؤثر في استقرار مما يشير إلى المجمعات. وهكذا توضيح آليات السيطرة على ديناميات البروتين تحديا جديداً في بيولوجيا الخلايا، اللازمة لفهم سبل توصيل الإشارات وتحديد مهام الخلية غير متوقعة.
وقد وضعت بعض وسائل بصرية لدراسة هذه التفاعلات في معيشة الخلايا1. ومن بين هذه، يسمح الانعكاس الداخلي الكلي مجهرية الفلورية (TIRF)، وضعت في أوائل الثمانينات، دراسة التفاعلات الجزيئية على أو بالقرب جداً من غشاء الخلية2. دراسة المعاملات الحيوية من الغشاء بروتين المسارات التي تم الحصول عليها من بيانات TIRF في الخلايا الحية، مطلوب جسيم واحد تتبع أسلوب (SPT). على الرغم من أن تتوفر عدة خوارزميات لذلك، نستخدم حاليا تلك التي نشرتها جاكامان et al.3 التي تعالج تباين الحركة الجسيمات في حقل جسيمات كثيفة التي تربط الجزيئات بين إطارات متتالية للاتصال المسار الناتج شرائح في مسارات كاملة (اختفاء الجسيمات مؤقتة). البرنامج يلتقط الجسيمات دمج وتقسيم تلك النتيجة من التجميع وتفكك الأحداث3. من بيانات الإخراج من هذا البرنامج الكشف عن الجسيمات على طول المسار الكامل بتحديد مواقفها X و Y في كل إطار.
وبمجرد اكتشاف الجسيمات، نقوم بتطبيق خوارزميات مختلفة لتحديد تيميلاج قصيرة نشرها معامل (د1-4)4،5. بتطبيق التحليل8 7،،من6لحظة قياس الطيف (MSS) أو عن طريق تركيب القيمة ‘ألفا’ بالتكيف للتشرد متوسط مربع (MSD) ل المنحنى9، نحن أيضا تصنيف الجسيمات استناداً إلى نوع المسار.
تحليل كثافة بقعة في الصور الأسفار هدف مشترك للعلماء في ميدان10،11. الخوارزمية الأكثر شيوعاً المستخدمة هو عدد ما يسمى والسطوع. ومع ذلك لا يسمح هذا الأسلوب الكشف الصحيح الإطار بكثافة في الجسيمات في كسر الجوال. ونحن، وهكذا ولدت خوارزمية جديدة لتقييم هذه الجسيمات كثافات الإطار حسب الإطار وتحديد حالتها التجميع. بمجرد اكتشاف إحداثيات كل الجسيمات باستخدام البرمجيات Track2 يو3، علينا أن نحدد كثافة في كل إطار عبر مسار كامل، أيضا مع مراعاة الخلفية الخلية في كل إطار. هذا البرنامج يوفر إمكانيات مختلفة لتحديد كثافة بقعة وخلفية الخلية، واستخدام البروتينات أحادي و dimeric المعروفة كمراجع، يحسب العدد التقريبي للبروتينات في الكشف عن الجسيمات (حجم الكتلة).
في هذه المقالة، يصف لنا دليل دقيق لتنفيذ الخطوات الثلاثة التالية: 1) كشف وتتبع الجسيمات واحدة على طول شريط فيديو للأسفار مجهرية باستخدام يو-المسار؛ 2) تحليل معامل نشر فوري (د1-4) لتلك الجزيئات ونوع الحركة (المحصورة أو الحرة أو الموجهة) الجسيمات مع مسارات طويلة من MSS؛ 3) قياس كثافة بقعة على طول الفيديو تصحيح بالأسفار الخلفية المقدرة لكل نقطة. وهذا يسمح لتقدير حجم الكتلة، وتحديد الخطوات فوتوبليتشينج.
استخدام هذا البروتوكول لا تتطلب مهارات متخصصة ويمكن أن يؤديها في أي مختبر مع ثقافة الخلية، والتدفق الخلوي والفحص المجهري مرافق. يستخدم البروتوكول إيماجيج أو فيجي (توزيع ImageJ12) والمسار يو3وبعض إجراءات المخصصة المقدمة الإعلانية (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). إجراءات يو–المسار والمخصصة دهس Matlab التي يمكن تثبيتها في أي كمبيوتر متوافق.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصف الأسلوب السهل للقيام حتى بدون وجود أي خبرة سابقة في العمل مع Matlab. بيد أن الروتين Matlab تتطلب بالغة الدقة مع تسمية الأوامر المختلفة وإضفاء الطابع المحلي على المجلدات المختلفة المستخدمة من قبل البرنامج. في التعقب التحليل الروتيني (الخطوة 3)، يمكن تعديل معلمات متعددة. نافذة “إعداد خليط ضباب?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نشكر مانزو كارلو وماريا غارسيا براجو للتعليمات البرمجية الخاصة بهم في التعليمات ومصدر لتحليل معامل نشر. بتأييد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من وزارة العلوم الإسبانية، والابتكار والجامعات (القوات المسلحة السودانية عام 2017-82940-R) وبرنامج ريتيكس معهد الصحة “كارلوس الثالث” (RD12/0009/009 و RD16/0012/0006؛ RIER). تدريبيا والشركة معتمدة من قبل برنامج كومفوتورو للسفن العامة مؤسسة.
Materials
| Human Jurkat cells | ATCC | CRL-10915 | Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software |
| pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP | Clontech | 632469 | Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine |
| Gene Pulse X Cell electroporator | BioRad | We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells. Use the transfection method best working in your hands. | |
| Cytomics FC 500 flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required. You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest. | |
| Dako Qifikit | DakoCytomation | K0078 | Used for quantification the number of receptors in the cell surface. |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek corporation | P35G-1.5-10-C | |
| Human Fibronectin from plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Recombinant human CXCL12 | PeproTech | 300928A | |
| Inverted Leica AM TIRF | Leica | ||
| EM-CCD camera | Andor | DU 885-CSO-#10-VP | |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | ||
| U-Track2 software | Danuser Laboratory | ||
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| FiJi | FiJI | https://imagej.net/Fiji) | |
| u-Track2 software | Matlab tool. For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice | ||
| GraphPad Prism | GraphPad software |
References
- Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
- Bakker, G. J., et al. Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).
- Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).
- Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. Strongly and weakly self-similar diffusion. Physica D. 154, 111-137 (2001).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).
- Ewers, H., et al. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).
- Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).
- Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).
- Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Martinez-Munoz, L., et al. Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function. Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).
- Destainville, N., Salome, L. Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments. Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).
