Transplantation intraventriculaire de précurseurs neuronaux artificiels pour les études de neuroarchitecture In Vivo

Ici nous décrivons une méthode simple que nous avons développée pour disséquer le contrôle in vivo de gène de cytoarchitecture neuronale. Basé sur l’ingénierie in vitro des précurseurs neuronaux, leur transplantation dans le cerveau néonatal et l’évaluation morphométrique couplée des cellules « d’essai » et de « contrôle », il permet de dévoiler des implications fonctionnelles des gènes de test dans le contrôle fin de la morphologie neuronale dans un moyen rapide et abordable. Pour étudier le contrôle in vivo des gènes de l’architecture neuronale, trois questions techniques clés doivent être abordées : (1) la réalisation d’une expression de gène d’intérêt (GOI) correctement modelée et un contrôle quantitatif précis de celui-ci; (2) obtenir une visualisation correctement segmentée des silhouettes neuronales distinctes; (3) obtenir une signification statistique des résultats tout en employant un nombre limité d’animaux.

Lorsqu’elles sont disponibles, les lignées mutantes de souris abritant des transgènes contrôlés par la tétracycline (tet) peuvent être le meilleur outil pour aborder le premier numéro¹. Alternativement, la transgenèse somatique peut être employée. Dans de tels cas, le transgène est délivré par électroporation² ou transduction virale³. Ensuite, il est conservé comme épisome (par exemple, lors de l’électroporation standard⁴), ou il est intégré dans le génome (au hasard, via l’intégrase rétrovirale^5;ou dans un endroit défini, via CRISPR-promouvoir recombinaison homologue (SLENDR)⁶ ).

Deuxièmement, la visualisation neuronale de la silhouette peut être réalisée par (a) l’étiquetage uniforme clairsemé ou (b) l’étiquetage différentiel dense. En ce qui concerne l’étiquetage clairsemé, des méthodologies avancées de golgi peuvent être employées⁷, certains minisets neuronaux peuvent être remplis par la biocytine⁸, et l’étiquetage sel et poivre peut être obtenu grâce à un transgène peu exprimé. Un tel transgène peut afficher une transcription variée (Thy-EGFP)⁹ ou peut être activé par recombinaison stochastique (MORF)¹⁰. En ce qui concerne (b), les stratégies de pointe comprennent la recombinaison stochastique à médiation C au sein d’un réseau de transgènes de fluoroprotéines multi-floxed (Brainbow)¹¹, ainsi que l’intégration génomique de gènes fluoroprotéines par la transpolation de piggyBac-transposase, précédemment par transgenèse somatique (CLoNE)¹².

En ce qui concerne le troisième problème, le résultat morphométrique est souvent affecté par une grande variabilité aléatoire, provenant de différences inter-animaux et les contingences d’injection cellulaire. Pour cette raison, un grand nombre d’animaux est généralement utilisé pour atteindre la puissance statistique nécessaire pour évaluer l’activité morphométrique GOI.

Les approches décrites précédemment reposent souvent sur des compétences techniques avancées et nécessitent des ressources financières remarquables, ce qui peut limiter leur diffusion au sein de la communauté scientifique. Pour contourner ces problèmes, nous avons conçu un pipeline simple et facile pour disséquer le contrôle génétique de la neuroarchitecture in vivo d’une manière rapide et abordable. Ceci est inspiré par une conception similaire de co-transplantation précédemment développée pour l’évaluation in vivo rapide de l’activité de transgène antiblastique¹³.

Plus précisément, on pense que la co-transplantation de précurseurs neuronaux « verts » in vitro (« cellules de test » et de « contrôle ») dans un cerveau néonatal « noir » peut simultanément corriger les trois questions clés énumérées ci-dessus. En fait, l’ingénierie lentivirale in vitro de précurseurs, dans des conditions bien contrôlées, permet le maintien de la variabilité de l’expression transgène neuronale au minimum, bien en dessous de celle habituellement associée à des manipulations somatiques in vivo (effectuées précédemment ^{14 (en) , 15} et dans nos résultats inédits). Le contrôle précis de l’expression des gènes qui en résulte est comparable à celui obtenu par des modèles transgéniques contrôlés par les tets. Cependant, les coûts de cette procédure sont bien inférieurs à ceux provenant de l’entretien d’une ligne de souris transgénique. Ensuite, l’injection de cellules à main levée est facile et nécessite une formation minimale. En outre, la quantité de précurseurs étiquetés injectés dans chaque cerveau peut être facilement réglée pour atteindre un nombre cumulatif suffisant de précurseurs peu distribués, tout en maintenant le nombre total d’animaux transplantés à un minimum. Enfin, la co-injection de précurseurs pseudoo-étiquetés différemment, « testés » et « témoins » et l’analyse statistique par paire s’ensuit des résultats contrecarrent les effets de la variabilité expérimentale interanimale, permettant d’atteindre l’importance statistique des résultats, même sur l’analyse d’un nombre limité d’individus¹³.

Il convient de souligner que, bien que rapide et bon marché, cette méthode a deux principales limites. Tout d’abord, il est conçu pour étudier le contrôle des gènes autonomes cellulaires de l’architecture neuronale, et il n’est pas approprié de s’attaquer au contrôle de l’environnement. Deuxièmement, comme les précurseurs neuronaux transplantés atteignent leur emplacement final par un calendrier hétérochronique, cette méthode est préférable au contrôle neuroarchitectonique modèle se produisant après l’achèvement de migration.