Intraveneuze triculaire transplantatie van engineered neuronale precursoren voor in vivo Neuroarchitecture studies
Summary
Op basis van in vitro lentivirale engineering van neuronale precursoren, hun co-transplantatie in wild-type hersenen en gepaarde morphometrische evaluatie van “test” en “Control” derivaten, maakt deze methode nauwkeurige modellering van in vivo gencontrole van neocorticale neuron morfologie op een eenvoudige en betaalbare manier.
Abstract
Genbeheersing van neuronale cytoarchitectuur is momenteel het onderwerp van intensief onderzoek. Hier beschreven is een eenvoudige methode ontwikkeld om in vivo gencontrole van neocorticale projectie neuron morfologie te bestuderen. Deze methode is gebaseerd op (1) in vitro lentivirale engineering van neuronale precursoren als “test” en “Control” cellen, (2) hun co-transplantatie in wild-type hersenen, en (3) gepaarde morphometrische evaluatie van hun neuronale derivaten. Specifiek, E 12.5 palliale precursoren van panneuronale, genetisch gelabelde donoren, worden gebruikt voor dit doel. Ze zijn ontworpen om te profiteren van geselecteerde promotors en tetON/OFF-technologie, en ze zijn vrije hand getransplanteerd in neonatale laterale ventrikels. Later, na immunofluorescentie profilering van ontvangende hersenen, silhouetten van getransplanteerde neuronen worden gevoed in NeurphologyJ open source software, hun morphometrische parameters worden geëxtraheerd, en de gemiddelde lengte en vertakkings index worden berekend. In vergelijking met andere methoden, deze biedt drie belangrijke voordelen: het maakt het bereiken van de fijne controle van transgen expressie tegen betaalbare kosten, het vereist alleen elementaire chirurgische vaardigheden, en het biedt statistisch betrouwbare resultaten bij analyse van een beperkte aantal dieren. Vanwege het ontwerp is het echter niet voldoende om niet-cel-autonome controle van neuro architectuur aan te pakken. Bovendien, het moet bij voorkeur worden gebruikt om te onderzoeken neuriet morfologie controle na voltooiing van neuronale migratie. In zijn huidige formulering is deze methode prachtig afgestemd op het onderzoeken van gencontrole van glutamaterge neocorticale neuron architectuur. Gebruik te maken van transgene lijnen uitdrukken EGFP in andere specifieke neurale celtypen, het kan worden hergebruikt voor het aanpakken van gencontrole van hun architectuur.
Introduction
Hier beschrijven we een eenvoudige methode die we hebben ontwikkeld om in vivo gencontrole van neuronale cytoarchitectuur te ontleden. Op basis van in vitro engineering van neuronale precursoren, hun transplantatie in neonatale hersenen en gepaarde morphometrische evaluatie van “test” en “Control” cellen, maakt het mogelijk om functionele implicaties van test genen te onthullen in de fijne beheersing van neuronale morfologie in een snelle en betaalbare manier. Om in vivo gencontrole van neuronale architectuur te onderzoeken, moeten drie belangrijke technische kwesties worden aangepakt: (1) het bereiken van een adequaat gedessineerde gen-of-Interest (GOI) expressie en een nauwkeurige kwantitatieve controle ervan; (2) het verkrijgen van een correct gesegmenteerde visualisatie van verschillende neuronale silhouetten; (3) het opwekken van statistische significantie van de resultaten terwijl een beperkt aantal dieren wordt tewerkstelt.
Indien beschikbaar, muis Mutant lijnen cellen tetracycline (tet)-gecontroleerde transgenes mogelijk de beste tool om het eerste nummer1aan te pakken. Als alternatief kan somatische Transgenese worden gebruikt. In dergelijke gevallen wordt het transgen geleverd via electroporatie2 of virale transductie3. Vervolgens wordt het bewaard als een episome (bijv. bij standaard elektroporation4), of het is geïntegreerd in het genoom (willekeurig, via retrovirale integrase5; of op een gedefinieerde locatie, via crispr-gepromoveerde homologe RECOMBINATIE (slendr)6 ).
Tweede, neuronale silhouet visualisatie kan worden bereikt via (a) sparse uniforme labeling of (b) dichte differentiële labeling. Wat betreft sparse labeling, geavanceerde Golgi-achtige methodologieën kunnen worden gebruikt7, geselecteerde neuronale minisets kunnen worden gevuld door biocytine8, en zout-en-peper labeling kan worden verkregen dankzij een dun uitgedrukt transgene. Een dergelijk transgen kan bonte transcriptie (Thy-EGFP)9 vertonen of kan worden geactiveerd door stochastische recombinatie (Morf)10. Als voor (b), State of Art strategieën omvatten CRE-gemedieerde stochastische recombinatie binnen een multi-floxed fluoroprotein transgen array (brainbow)11, evenals piggybac-transposase-driven genomische integratie van fluoroprotein genen, eerder geleverd via somatische Transgenese (kloon)12.
Wat betreft het derde probleem, wordt de morometrische uitkomst vaak beïnvloed door een grote willekeurige variabiliteit, afkomstig van verschillen tussen dieren en contingenties van de celinjectie. Hierdoor wordt een groot aantal dieren gewoonlijk gebruikt om het statistische vermogen te bereiken dat nodig is om de werking van de GOI-Morfometrische activiteit te beoordelen.
De eerder beschreven benaderingen zijn vaak gebaseerd op geavanceerde technische vaardigheden en vereisen opvallende financiële middelen, die hun verspreiding binnen de wetenschappelijke gemeenschap kunnen beperken. Om deze problemen te omzeilen, hebben we een eenvoudige en ongecompliceerde pijpleiding bedacht om op een snelle en betaalbare manier de genbeheersing van neuro architectuur in vivo te ontleden. Dit is geïnspireerd door een soortgelijk co-transplantatie ontwerp dat eerder is ontwikkeld voor een snelle in vivo evaluatie van antiblastische transgen activiteit13.
Specifiek, er wordt gedacht dat de co-transplantatie van in vitro engineered “groene” neurale precursoren (“test” en “controle” cellen) in een “zwarte” ontvangende neonatale hersenen kunnen tegelijkertijd de drie belangrijkste problemen die hierboven vermeld. In vitro lentivirale engineering van precursoren, in goed gecontroleerde omstandigheden, maakt het mogelijk om de variabiliteit van neuronale transgenexpressie minimaal te onderhouden, ver onder die meestal geassocieerd met somatische manipulaties (eerder uitgevoerd 14 , 15 en in onze niet-gepubliceerde resultaten). De resulterende nauwkeurige controle van genexpressie is vergelijkbaar met die bereikt door Tet-gecontroleerde transgene modellen. De kosten van deze procedure liggen echter ver onder die van het onderhoud van een transgene muis lijn. Volgende, vrije-hand celinjectie is eenvoudig en vereist minimale training. Bovendien kan de hoeveelheid gelabelde precursoren die in elke hersenen worden geïnjecteerd, gemakkelijk worden afgestemd om een voldoende Cumulatief aantal dunbevolkte precursoren te bereiken, terwijl ook het totale aantal getransplanteerde dieren minimaal blijft. Niet in de laatste plaats, co-injectie van verschillend fluoro-gelabeld, “test”-en “controle”-precursoren en daaropvolgende Pairwise statistische analyse van de resultaten neutraliseren de effecten van de experimentele variabiliteit van de Inter-Animal, waardoor het bereiken van statistische significantie van de resultaten, zelfs bij de analyse van een beperkt aantal personen13.
Benadrukt moet worden dat deze methode, zij het snel en voordelig, twee belangrijke beperkingen heeft. Ten eerste is het ontworpen om de celautonome gencontrole van neuronale architectuur te onderzoeken, en het is niet gepast om de milieucontrole aan te pakken. Ten tweede, aangezien getransplanteerde neuronale precursoren hun uiteindelijke locatie bereiken met een heterochronisch schema, verdient deze methode de voorkeur om neuroarchitectonische controle te modelleren die plaatsvindt na voltooiing van de migratie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Specifieke aspecten/stappen van deze procedure zijn van cruciaal belang en vereisen speciale aandacht. Ten eerste moeten (a) exploitanten adequaat zijn vooropgeleid om lentivirussen veilig te manipuleren in een BSL-2-conforme labomgeving. Ten tweede, (b) voorafgaand aan het mengen van “test” en “controle” neurale preparaten, is het verplicht om de twee overeenkomstige neurosphere suspensies zorgvuldig te wassen zoals beschreven, om een vertraagde kruisbesmetting van de twee preparaten te voorkomen als gevolg van ongewens…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Mihn Duc do voor zijn bijdrage aan de vroegtijdige instelling van deze procedure.
Materials
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 ℃ |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at +4 ℃ |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 ℃ |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at +4 ℃ |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at +4 ℃ |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | DispoMold07 |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 ℃ |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at +4 ℃ |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at +4 ℃ |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 ℃ |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 ℃ |
| Fine scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 ℃ |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 ℃ |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 ℃ |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at +4 ℃ |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 ℃ |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | store at RT |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | Flaming/Brown Micropipette Puller |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 ℃ |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | ||
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | ||
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | ||
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 ℃ |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at +4 ℃ |
References
- Kistner, A., et al. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. . Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Puram, S. V., et al. A CaMKIIβ 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. , (2011).
- Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing. Cell. , (2016).
- Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy. Brain Structure and Function. , (2011).
- Chen, B., et al. The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. , (2000).
- Lu, X. H., Yang, X. W. Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift. Scientific Reports. , (2017).
- Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. , (2013).
- Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. , (2014).
- Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma. Oncotarget. , (2016).
- Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis. Stem Cells. , (2010).
- Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex. Scientific Reports. , (2016).
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nature Neuroscience. , (2001).
- Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. Culture of mouse neural stem cell precursors. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Puzzolo, E., Mallamaci, A. Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment. Neural Development. , (2010).
- . . NeurphologyJ Manual. , (2012).
- Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation. Cerebral Cortex. , (2018).
