Внутрижелудочковая трансплантация инженерных нейронных прекурсоров для исследований нейроархитектуры In Vivo
Summary
На основе in vitro лентивирной инженерии нейрональных прекурсоров, их совместной трансплантации в мозг дикого типа и парной морфометрической оценки “тест” и “контроль” производных, этот метод позволяет точное моделирование in vivo генного контроля неокортикальных морфология нейронов в простой и доступный способ.
Abstract
Генное управление нейрональной цитоархитектуры в настоящее время является предметом интенсивного исследования. Описан простой метод, разработанный для изучения виво-генного контроля неокортикальной проекционной морфологии нейронов. Этот метод основан на (1) in vitro lentiviral engineering нейрональных прекурсоров как “тест” и “контроль” клетки, (2) их совместной трансплантации в мозг дикого типа, и (3) парной морфометрической оценки их нейрональных производных. В частности, для этой цели используются прекурсоры E12.5 pallial от паннейрональных, генетически помеченных доноров. Они разработаны, чтобы воспользоваться выбранными промоутеров и тетон / OFF технологии, и они свободной руки трансплантированы в неонатальных боковых желудочков. Позже, при иммунофлуоресценцическом профилировании мозга реципиента, силуэты пересаженных нейронов подаются в программное обеспечение с открытым исходным кодом NeurphologyJ, извлекаются их морфометрические параметры, рассчитывается средняя длина и индекс ветвления. По сравнению с другими методами, этот предлагает три основных преимущества: он позволяет достичь тонкого контроля трансгенного экспрессии по доступным ценам, он требует только базовых хирургических навыков, и он обеспечивает статистически надежные результаты при анализе ограниченного животных. Из-за своей конструкции, однако, это не является адекватным для решения не клеток автономного контроля нейроархитектуры. Кроме того, он должен быть предпочтительно использовать для исследования контроля невритной морфологии после завершения миграции нейронов. В своей нынешней формулировке, этот метод изысканно настроен для исследования генного контроля глутаматергической неокортикальной архитектуры нейронов. Воспользовавшись трансгенными линиями, выражающими EGFP в других конкретных типах нейронных клеток, его можно перепрофилировать для решения проблемы генного контроля их архитектуры.
Introduction
Здесь мы описываем простой метод, который мы разработали для вскрытия виво генного контроля нейрональной цитоархитектуры. На основе интроинженерии нейронных прекурсоров, их трансплантации в неонатальный мозг и парной морфометрической оценки “тест” и “контроль” клеток, это позволяет раскрыть функциональные последствия тестовых генов в тонком контроле нейрональной морфологии в быстрый и доступный способ. Для изучения виво-генного контроля нейронной архитектуры необходимо решить три ключевых технических вопроса: (1) достижение адекватно узорчатого выражения гена интересов (GOI) и точного количественного контроля над ним; (2) получение правильно сегментированной визуализации различных нейрональных силуэтов; (3) получение статистической значимости результатов при использовании ограниченного числа животных.
При наличии, мыши мутант линий укрывательство тетрациклин (тет) контролируемых трансгенов может быть лучшим инструментом для решения первого вопроса1. Кроме того, может быть использован соматический трансгенез. В таких случаях трансген доставляется через электропорацию2 или вирусную трансдукцию3. Далее, он сохраняется в качестве эписома (например, при стандартной электропорации4),или он интегрируется в геном (случайно, через ретровирусную интегразу5; или в определенном месте, через CRISPR-раскрученная гомологическая рекомбинация (SLENDR)6 ).
Во-вторых, визуализация нейрональных силуэтов может быть достигнута с помощью а) разреженной равномерной маркировки или b) плотной дифференциальной маркировки. Что касается разреженной маркировки, передовые Golgi-подобные методологии могут быть использованы7, выбранные нейрональные минисеты могут быть заполнены биоцитина8, и соль и перец маркировки могут быть получены благодаря редко выраженный трансген. Такой трансген может отображать пеструю транскрипцию (Thy-EGFP)9 или может быть активирован стохастической рекомбинацией (MORF)10. Что касается b), современные стратегии включают Cre-опосредованной стохастической рекомбинации в мульти-флоксированный флюоропротеин трансген массива (Brainbow)11, а также поросенокBac-транспозаса инициативе геномной интеграции генопротеитов, ранее осуществляется через соматический трансгенез (CLoNE)12.
Что касается третьего вопроса, то на морфометрический исход часто влияет большая случайная изменчивость, возникающая из межживотных различий и непредвиденных обстоятельств в клеточных инъекциях. Из-за этого, большое количество животных, как правило, используется для достижения статистической мощности, необходимой для оценки ГОИ морфометрической активности.
Описанные ранее подходы часто опираются на передовые технические навыки и требуют заметных финансовых ресурсов, которые могут ограничить их распространение в научном сообществе. Чтобы обойти эти проблемы, мы задумали простой и простой трубопровод для вскрытия генного контроля нейроархитектуры in vivo быстрым и доступным способом. Это вдохновлено аналогичной конструкцией совместной трансплантации, ранее разработанной для быстрой оценки виво антибластной трансгенной активности13.
В частности, считается, что совместное трансплантации in vitro инженерии “зеленых” нейронных прекурсоров (“тест” и “контроль” клетки) в “черный” получатель неонатального мозга может одновременно исправить три ключевых вопросов, перечисленных выше. В самом деле, in vitro лентивирной инженерии прекурсоров, в хорошо контролируемых условиях, позволяет поддержание изменчивости нейрональной трансгенной экспрессии, как минимум, гораздо ниже, что обычно связано с in vivo соматические манипуляции (выполненные ранее 14 Год , 15 и в наших неопубликованных результатах). В результате точный контроль экспрессии генов сопоставим с тем, что достигается тет-контролируемыми трансгенными моделями. Однако затраты на эту процедуру значительно ниже затрат, связанных с обслуживанием трансгенной линии мыши. Далее, инъекция клеток свободной руки проста и требует минимальной подготовки. Кроме того, количество помеченных прекурсоров, вводимых в каждый мозг, может быть легко настроено для достижения достаточного совокупного числа малораспределенных прекурсоров, сохраняя при этом общее число пересаженных животных на минимальном уровне. И последнее, но не менее, совместное введение по-разному флюоро-маркированных, “тест” и “контроль” прекурсоров и последующий парный статистический анализ результатов противодействовать воздействию межживотных экспериментальной изменчивости, что позволяет достичь статистической значимости результатов, даже при анализе ограниченного числа лиц13.
Следует подчеркнуть, что, хотя и быстро и дешево, этот метод имеет два основных ограничения. Во-первых, он предназначен для исследования клеточного автономного генного контроля нейронной архитектуры, и не подходит для решения проблемы экологического контроля. Во-вторых, по мере того, как трансплантированные нейронные прекурсоры достигают своего конечного места по гетерохроническому графику, этот метод предпочтительнее моделировать нейроархитектуру управления, происходящие в прошлом завершении миграции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Конкретные аспекты/шаги этой процедуры имеют решающее значение и требуют особого внимания. Во-первых, а) операторы должны быть надлежащим образом подготовлены к безопасному манипулированию лентивирусами в лабораторной среде, соответствующей требованиям BSL-2. Во-вторых, b) до смешивания…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Мина Дюка До за его вклад в скорейшее создание этой процедуры.
Materials
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 ℃ |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at +4 ℃ |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 ℃ |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at +4 ℃ |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at +4 ℃ |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | DispoMold07 |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 ℃ |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at +4 ℃ |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at +4 ℃ |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 ℃ |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 ℃ |
| Fine scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 ℃ |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 ℃ |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 ℃ |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at +4 ℃ |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 ℃ |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | store at RT |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | Flaming/Brown Micropipette Puller |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 ℃ |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | ||
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | ||
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | ||
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 ℃ |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at +4 ℃ |
References
- Kistner, A., et al. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. . Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Puram, S. V., et al. A CaMKIIβ 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. , (2011).
- Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing. Cell. , (2016).
- Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy. Brain Structure and Function. , (2011).
- Chen, B., et al. The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. , (2000).
- Lu, X. H., Yang, X. W. Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift. Scientific Reports. , (2017).
- Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. , (2013).
- Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. , (2014).
- Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma. Oncotarget. , (2016).
- Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis. Stem Cells. , (2010).
- Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex. Scientific Reports. , (2016).
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nature Neuroscience. , (2001).
- Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. Culture of mouse neural stem cell precursors. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Puzzolo, E., Mallamaci, A. Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment. Neural Development. , (2010).
- . . NeurphologyJ Manual. , (2012).
- Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation. Cerebral Cortex. , (2018).
