Trasplante Intraventricular de Precursores Neuronales Deingidos para Estudios de Neuroarquitectura In Vivo
Summary
Basado en la ingeniería lentiviral in vitro de precursores neuronales, su co-trasplante en cerebros de tipo salvaje y evaluación morfométrica emparejada de derivados de “prueba” y “control”, este método permite el modelado preciso del control genético in vivo del neocortical morfología de las neuronas de una manera simple y asequible.
Abstract
El control genético de la citoarquitectura neuronal es actualmente objeto de una investigación intensiva. Aquí se describe un método simple desarrollado para estudiar el control del gen in vivo de la morfología de la neurona de proyección neocortical. Este método se basa en (1) la ingeniería lentiviral in vitro de precursores neuronales como células de “prueba” y “control”, (2) su cotrasplante en cerebros de tipo salvaje, y (3) la evaluación morfométrica emparejada de sus derivados neuronales. Específicamente, e12.5 precursores palliales de panneuronal, donantes genéticamente etiquetados, se emplean para este propósito. Están diseñados para aprovechar los promotores seleccionados y la tecnología tetON/OFF, y se trasplantan a mano alzada en ventrículos laterales neonatales. Más tarde, tras el perfil de inmunofluorescencia de los cerebros receptores, las siluetas de las neuronas trasplantadas se introducen en el software de código abierto NeurphologyJ, se extraen sus parámetros morfométricos y se calculan la longitud media y el índice de ramificación. En comparación con otros métodos, este ofrece tres ventajas principales: permite lograr un control fino de la expresión transgénica a costos asequibles, sólo requiere habilidades quirúrgicas básicas, y proporciona resultados estadísticamente confiables tras el análisis de una número de animales. Debido a su diseño, sin embargo, no es adecuado para abordar el control no autónomo celular de la neuroarquitectura. Además, se debe utilizar preferentemente para investigar el control morfológico de neurita después de la finalización de la migración neuronal. En su formulación actual, este método está exquisitamente ajustado para investigar el control genético de la arquitectura de neuronas neocorticales glutamatérgicas. Aprovechando las líneas transgénicas que expresan EGFP en otros tipos específicos de células neurales, se puede reutilizar para abordar el control genético de su arquitectura.
Introduction
Aquí describimos un método simple que desarrollamos para diseccionar el control genético in vivo de la citoarquitectura neuronal. Basado en la ingeniería in vitro de precursores neuronales, su trasplante en cerebro neonatal y evaluación morfométrica emparejada de células de “prueba” y “control”, permite revelar implicaciones funcionales de genes de prueba en el control fino de la morfología neuronal en un manera rápida y asequible. Para investigar el control genético in vivo de la arquitectura neuronal, deben abordarse tres cuestiones técnicas clave: 1) lograr una expresión genética de interés (GOI) adecuadamente modelada y un control cuantitativo preciso de la misma; (2) obtener una visualización correctamente segmentada de siluetas neuronales distintas; 3) obtener una significancia estadística de los resultados mientras se emplea un número limitado de animales.
Cuando están disponibles, las líneas mutantes de ratón que albergan transgenes controlados por tetraciclina (tet) pueden ser la mejor herramienta para abordar el primer problema1. Alternativamente, se puede emplear transgénesis somática. En tales casos, el transgén se entrega a través de la electroporación2 o la transducción viral3. A continuación, se conserva como un epísmio (por ejemplo, sobre la electroporación estándar4), o se integra en el genoma (aleatoriamente, a través de la integrasa retroviral5; o en un lugar definido, a través de la recombinación homóloga promovida por CRISPR (SLENDR)6 ).
En segundo lugar, la visualización de la silueta neuronal puede lograrse mediante (a) etiquetado uniforme disperso o (b) etiquetado diferencial denso. En cuanto al etiquetado escaso, se pueden emplearmetodologías avanzadas similares a Golgi 7, los miniconjuntos neuronales seleccionados pueden ser llenados por biocictina8,y el etiquetado de sal y pimienta se puede obtener gracias a un transgén escasamente expresado. Dicho transgén puede mostrar transcripción variada (Thy-EGFP)9 o puede activarse mediante recombinación estocástica (MORF)10. En cuanto a (b), las estrategias de vanguardia incluyen la recombinación estocástica mediada por Cre dentro de una matriz transgénica de fluoroproteínas multifloxadas (Brainbow)11,así como la integración genómica impulsada por piggyBac-transposasa de genes de fluoroproteínas, anteriormente entregada a través de la transgénesis somática (CLoNE)12.
En cuanto a la tercera cuestión, el resultado morfométrico a menudo se ve afectado por una gran variabilidad aleatoria, originada por diferencias entre animales y contingencias de inyección celular. Debido a esto, un gran número de animales se emplea generalmente para lograr el poder estadístico necesario para evaluar la actividad morfométrica GOI.
Los enfoques descritos anteriormente a menudo se basan en habilidades técnicas avanzadas y requieren recursos financieros visibles, lo que puede limitar su difusión dentro de la comunidad científica. Para eludir estos problemas, concebimos una canalización fácil y directa para diseccionar el control genético de la neuroarquitectura in vivo de una manera rápida y asequible. Esto se inspira en un diseño similar de co-trasplante previamente desarrollado para una evaluación rápida in vivo de la actividad transgén al trasgeno antiblástica13.
Específicamente, se cree que el co-trasplante de precursores neuronales “verdes” de ingeniería in vitro (“células de prueba” y “control”) en un cerebro neonatal receptor “negro” puede corregir simultáneamente los tres problemas clave mencionados anteriormente. De hecho, la ingeniería lentiviral in vitro de precursores, en condiciones bien controladas, permite el mantenimiento de la variabilidad de la expresión transgénica neuronal como mínimo, muy por debajo de la generalmente asociada con manipulaciones in vivo somáticas (realizadas previamente 14 , 15 y en nuestros resultados inéditos). El control preciso resultante de la expresión génica es comparable al logrado por los modelos transgénicos controlados por tet. Sin embargo, los costes de este procedimiento están muy por debajo de los derivados del mantenimiento de una línea de ratón transgénica. A continuación, la inyección de células a mano alzada es fácil y requiere un entrenamiento mínimo. Además, la cantidad de precursores etiquetados inyectados en cada cerebro se puede ajustar fácilmente para lograr un número acumulado suficiente de precursores escasamente distribuidos, manteniendo al mismo tiempo el número total de animales trasplantados como mínimo. Por último, pero no menos importante, la coinyección de precursores de etiqueta fluorada, “prueba” y “control” de manera diferente y el posterior análisis estadístico por pares de los resultados contrarrestan los efectos de la variabilidad experimental interanimal, permitiendo alcanzar significación estadística de los resultados, incluso tras el análisis de un número limitado de individuos13.
Cabe destacar que, aunque rápido y barato, este método tiene dos limitaciones principales. En primer lugar, está diseñado para investigar el control genético autónomo celular de la arquitectura neuronal, y no es apropiado para abordar el control ambiental. En segundo lugar, a medida que los precursores neuronales trasplantados llegan a su ubicación final por un horario heterocrónico, este método es preferible a modelar el control neuroarquitectónico que se produce después de la finalización de la migración.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los aspectos/pasos específicos de este procedimiento son críticos y requieren una atención especial. En primer lugar, (a) los operadores deben estar adecuadamente preparados para manipular de forma segura los lentivirus en un entorno de laboratorio compatible con BSL-2. En segundo lugar, b) antes de mezclar las preparaciones neuronales de “prueba” y “control”, es obligatorio lavar cuidadosamente las dos suspensiones de neuroesfera correspondientes como se describe, con el fin de prevenir cualquier infección cruzada r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Mihn Duc Do por su contribución a la configuración temprana de este procedimiento.
Materials
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 ℃ |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at +4 ℃ |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 ℃ |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at +4 ℃ |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at +4 ℃ |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | DispoMold07 |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 ℃ |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at +4 ℃ |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at +4 ℃ |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 ℃ |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 ℃ |
| Fine scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 ℃ |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 ℃ |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 ℃ |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at +4 ℃ |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 ℃ |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | store at RT |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | Flaming/Brown Micropipette Puller |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 ℃ |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | ||
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | ||
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | ||
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 ℃ |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at +4 ℃ |
References
- Kistner, A., et al. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. . Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Puram, S. V., et al. A CaMKIIβ 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. , (2011).
- Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing. Cell. , (2016).
- Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy. Brain Structure and Function. , (2011).
- Chen, B., et al. The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. , (2000).
- Lu, X. H., Yang, X. W. Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift. Scientific Reports. , (2017).
- Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. , (2013).
- Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. , (2014).
- Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma. Oncotarget. , (2016).
- Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis. Stem Cells. , (2010).
- Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex. Scientific Reports. , (2016).
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nature Neuroscience. , (2001).
- Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. Culture of mouse neural stem cell precursors. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Puzzolo, E., Mallamaci, A. Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment. Neural Development. , (2010).
- . . NeurphologyJ Manual. , (2012).
- Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation. Cerebral Cortex. , (2018).
