השתלת השתלות מהונדסים של הנדסה עצבית בVivo לימודי נוירוארכיטקטורה
Summary
בהתבסס על הנדסת חוץ גופית ויראלי של מראש עצבי, שיתוף ההשתלה שלהם למוח פראי סוג ולזווג הערכה מורמטרית של “מבחן” ו “שליטה” נגזרים, שיטה זו מאפשרת דוגמנות מדויקת של בקרת vivo gene של הנאוקורטילית עצב מורפולוגיה בדרך פשוטה ובמחיר סביר.
Abstract
השליטה הגנטית באדריכלות העצבית. היא הנושא של חקירה אינטנסיבית מתוארים כאן היא שיטה פשוטה שפותחה ללמוד בקרת גנים vivo של מורפולוגיה הקרנה הניאו קליפת המוח. שיטה זו מבוססת על (1) בהנדסה מחוץ לתחום ויראלי של הנדסה עצבית מסוג “מבחן” ו-“שליטה” תאים, (2) שיתוף הפעולה שלהם למוח פראי, ו (3) לזווג הערכה מורמטרית של נגזרות עצבי שלהם. באופן ספציפי, E 12.5 מסמני מקדים מתורמים בעלי התווית גנטית, מעובדים בעלי התוויות, מועסקים למטרה זו. הם מתוכננים כדי לנצל את היזמים שנבחרו, tetON/OFF הטכנולוגיה, והם בחינם יד מושתלים לתוך החדרים לרוחב הלובין. מאוחר יותר, על הפרופילים של המוח המושתלים של מוחות הנמען, צלליות של נוירונים מושתלים מוזנים לתוך התוכנה הקוד הפתוח עצבי, הפרמטרים שלהם מורמטרים מופקים, ואת האורך הממוצע מדד הסתעפות מחושבים. בהשוואה לשיטות אחרות, אחד זה מציע שלושה יתרונות עיקריים: הוא מתיר השגת שליטה עדינה של ביטוי טרנזגני במחיר סביר, זה רק דורש כישורי ניתוח בסיסיים, והוא מספק תוצאות אמינות סטטיסטית על ניתוח מוגבל ספר בעלי חיים. בגלל העיצוב שלה, עם זאת, זה לא מספיק כדי לטפל שאינו השליטה האוטונומית התא של נוירוארכיטקטורה. כמו-כן, רצוי להשתמש בה כדי לחקור שליטה neurite ורפולוגיה לאחר השלמת הגירה עצבית. בניסוח הנוכחי שלה, שיטה זו מכוונת להפליא כדי לחקור בקרת גנים של האדריכלות נוירונים glutamatergic neoקורטיקלית. ניצול של קווים טרנסגניים המבטא EGFP בסוגים אחרים של תאים עצביים ספציפיים, זה יכול להיות מחדש תכליתי כדי לטפל בקרת גנים של הארכיטקטורה שלהם.
Introduction
כאן אנו מתארים שיטה פשוטה שפיתחנו לנתח בקרת גנים vivo של אדריכלות עצבית. מבוסס על הנדסת חוץ גופית של מקדים עצביים, ההשתלה שלהם לתוך המוח הבין לבין הערכה מוגרמטרית של “מבחן” ו “שליטה” תאים, זה מאפשר לחשוף את ההשלכות תפקודית של גנים מבחן בשליטה עדינה של מורפולוגיה עצבית ב דרך מהירה ומשתלמת. כדי לחקור בקרת גנים vivo של אדריכלות עצבית, שלושה נושאים טכניים מרכזיים חייב להיות ממוען: (1) השגת ביטוי גן התעניינות מספקת (הגוי) ושליטה כמותית מדויקת של אותו; (2) קבלת הדמיה מקוטעת כראוי של צלליות נוירואליות נפרדות; (3) מעורר משמעות סטטיסטית של תוצאות תוך העסקת מספר מוגבל של בעלי חיים.
כאשר זמין, העכבר מוטציה קווים מחסה טטרציקלין (ט) מבוקרת transgenes עשוי להיות הכלי הטוב ביותר כדי לטפל בגיליון הראשון1. לחילופין, הטרנסגנזה הסומטית עשויה להיות מועסק. במקרים כאלה, הטרנסגנטית מועברת באמצעות אלקטרופורציה2 או התמרה נגיפית3. לאחר מכן, הוא נשמר כאפיכמה (למשל, על-ידי אלקטרופורציה סטנדרטית4), או שהוא משולב לתוך הגנום (באופן אקראי, באמצעות שילובים retroviral יעיל5; או במיקום מוגדר, באמצעות crispr-קידם הומולוציה שילוב מחדש (slendr)6 ).
שנית, צללית עצבית הדמיה עשוי להיות מושגת באמצעות (a) מדים דלילים תיוג או (ב) צפוף תיוג דיפרנציאלי. באשר לתיוג דליל, מתודולוגיות מתקדמות כמו Golgi עשוי להיות מועסק7, מיניסטים עצביים שנבחרו ניתן למלא על ידי biocytin8, ותיוג מלח ופלפל ניתן להשיג תודות לגנים מבוטא בדלילות. כזה יכול להציג שעתוק מגוון (שלך-EGFP)9 או יכול להיות מופעל על ידי שילוב סטוכסטי (morf)10. באשר (ב), המדינה של אסטרטגיות האמנות כוללים מתווך של היצור-תיווך סטוכסטי שילוב של בתוך מערך מרובה פלואופאנפרוטאין transopחלבון (במוח)11, כמו גם שילוב של מונחה גנומה-טרנספססאוסה של גנים fluoroprotein, בעבר נמסר באמצעות טרנסגנזה סומטית (שיבוט)12.
באשר לסוגיה השלישית, התוצאה המורמטרית מושפעת לעתים קרובות על ידי שינויים אקראיים גדולים, שמקורם הבדלים בין בעלי חיים ואפשרויות הזרקת תאים. בגלל זה, מספר גדול של בעלי חיים מועסק בדרך כלל כדי להשיג את הכוח הסטטיסטי הדרוש כדי להעריך את הפעילות הטובה ביותר של מורמטרי.
הגישות שתוארו לעיל מסתמכות לעתים קרובות על מיומנויות טכניות מתקדמות ודורשות משאבים פיננסיים בולט, אשר עשויים להגביל את הדיפוזיה שלהם בתוך הקהילה המדעית. כדי לעקוף בעיות אלה, הצלחנו צינור קל ופשוט לנתח את השליטה גנים של נוירוארכיטקטורה ב vivo בדרך מהירה ובמחיר נוח. זה מעורר השראה על ידי עיצוב דומה שיתוף השתלת בעבר שפותחה במהירות vivo הערכה של פעילות antiblastic transgene13.
באופן ספציפי, הוא חשב כי השתלת המשותף של הנדסה חוץ גופית “ירוק” מקדים עצביים (“מבחן” ו “שליטה” תאים) לתוך המוח התינוק “שחור” התינוק יכול במקביל לתקן את שלושת הנושאים המרכזיים המפורטים לעיל. למעשה, בהנדסה מחוץ לתחום ויראלי של סמנים מוקדמים, בתנאים מבוקרים היטב, מאפשר תחזוקה של השתנות הביטוי העצבי-מגנטי במינימום, הרחק מתחת כי בדרך כלל הקשורים במניפולציות vivo סומטיים (שבוצעה בעבר מיכל בן 14 , 15 ובתוצאות שלא פורסמו. השליטה המדויקת המתקבלת על ביטוי הגנים דומה לזו שהושגה במודלים טרנסגניים מבוקרים. עם זאת, עלויות של הליך זה הן הרבה מתחת לאלה שמקורן בתחזוקת קו העכבר הטרנסגניים. לאחר מכן, הזרקת התא החופשי היא קלה ודורשת הכשרה מינימלית. כמו-כן, ניתן לכוונן בקלות את כמות הסמנים המושתלים המוזרקים לתוך כל מוח כדי להשיג מספר מצטבר מספיק של מקדם-סמנים בדלילות, תוך שמירה על המספר הכולל של חיות משושתלים במינימום. אחרון חביב, שיתוף הזרקה של fluoro שונים מתויג, “מבחן” ו-“שליטה” מראש סמנים וניתוח סטטיסטי הבאים של התוצאות לנטרל את ההשפעות של בעלי חיים השונות ניסיוני, המאפשר להגיע של משמעות סטטיסטית של תוצאות, גם על ניתוח של מספר מוגבל של אנשים13.
יודגש כי, אם כי מהיר וזול, שיטה זו יש שתי מגבלות עיקריות. ראשית, היא נועדה לחקור את השליטה הגנטית התאית של האדריכלות העצבית, וזה לא מתאים לטפל בשליטה סביבתית. שנית, כמו מושתלים המושתלים טרום המעבר להגיע למיקום הסופי שלהם על ידי לוח זמנים הטרוכרוני, שיטה זו עדיפה על מודל שליטה נוירופרטונידנטים המתרחשים השלמת הגירה בעבר.
Protocol
Representative Results
Discussion
היבטים/צעדים ספציפיים של הליך זה הם קריטיים ודורשים תשומת לב מיוחדת. ראשית, (א) אופרטורים חייבים להיות מאומנים בצורה מספקת כדי לתפעל בביטחה את הווירוסים בסביבת מעבדה תואמת BSL-2. שנית, (ב) לפני ערבוב “מבחן” ו “שליטה” ההכנות העצביות, זה הכרחי כדי לשטוף בזהירות את שני השעיות נוירוספירה המקביל כפי ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לקרן דוק על תרומתו לשלב מוקדם של הליך זה.
Materials
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 ℃ |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at +4 ℃ |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 ℃ |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at +4 ℃ |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at +4 ℃ |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | DispoMold07 |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 ℃ |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at +4 ℃ |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at +4 ℃ |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 ℃ |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 ℃ |
| Fine scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 ℃ |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 ℃ |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 ℃ |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at +4 ℃ |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 ℃ |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | store at RT |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | Flaming/Brown Micropipette Puller |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 ℃ |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | ||
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | ||
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | ||
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 ℃ |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at +4 ℃ |
References
- Kistner, A., et al. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. . Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Puram, S. V., et al. A CaMKIIβ 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. , (2011).
- Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing. Cell. , (2016).
- Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy. Brain Structure and Function. , (2011).
- Chen, B., et al. The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. , (2000).
- Lu, X. H., Yang, X. W. Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift. Scientific Reports. , (2017).
- Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. , (2013).
- Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. , (2014).
- Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma. Oncotarget. , (2016).
- Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis. Stem Cells. , (2010).
- Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex. Scientific Reports. , (2016).
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nature Neuroscience. , (2001).
- Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. Culture of mouse neural stem cell precursors. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Puzzolo, E., Mallamaci, A. Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment. Neural Development. , (2010).
- . . NeurphologyJ Manual. , (2012).
- Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation. Cerebral Cortex. , (2018).
