Позиционирующее устройство для размещения мышей во время интраназального siRNA Доставка в центральную нервную систему
Summary
Здесь мы представляем протокол с помощью устройства позиционирования мыши, которое позволяет соответствующее размещение мышей для интраназального введения мозга таргетинга пептид-siRNA формулировки, позволяющей эффективное заглушивание гена в центральной нервной системе.
Abstract
Интраназальное (ИН) доставка наркотиков в мозг стала перспективным методом обхода гематоэнцефалического барьера (BBB) для доставки препаратов в центральную нервную систему (ЦНС). Недавние исследования показывают использование пептида, RVG9R, включающего минимальный рецептор-связывающий домен гликопротеина вируса бешенства, в вызывая доставку siRNA в нейроны в мозге. В этом протоколе, пептид-siRNA формулировка поставляется интраназно с пипеткой в доминирующей руке, в то время как анестезирующая мышь сдерживается потертости с недоминирующей стороны в “голова вниз и вперед позиции”, чтобы избежать дренажа в легких и желудок при вдыхании. Это точное захват мышей можно узнать, но не легко и требует практики и навыков, чтобы привести к эффективному поглощению ЦНС. Кроме того, процесс является длительным, требующим около 45 мин для введения общего объема в размере 20-30 евро раствора в 1-2 л капельных объемов на вдох, с 3-4 мин периоды отдыха между каждым вдохом. Целью данного исследования является раскрытие устройства позиционирования мыши, которое позволяет соответствующее размещение мышей для эффективного в ней управления пептид-siRNA формулировки. Несколько функций включены в конструкцию устройства, такие как четыре или восемь позиционирующих стульев с регулируемой высотой и наклоном, чтобы сдержать обезображенных мышей в положении вниз и вперед, что позволяет легко визуализировать носы мышей и встроенный грелоприбор для поддержания температуры тела мышей во время процедуры. Важно отметить, что способность лечить четырех или восьми мышей одновременно с комплексами RVG9R-siRNA таким образом позволяет проводить исследования в гораздо более быстром временном масштабе для тестирования подхода IN therapeutic siRNA. В заключение, это устройство позволяет для соответствующего и контролируемого расположения головы мыши для в применении RVG9R-siRNA и других терапевтических молекул, таких как наночастицы или антитела, для доставки ЦНС.
Introduction
BBB предотвращает системно управляемых молекул йgt;400-600 Da от входа в мозг, что создает значительную проблему для доставки терапевтических биомолекул для заболеваний, влияющих на ЦНС и мозг1. Прямая доставка лекарств в мозг может быть достигнута путем стереотаксической инъекции; однако, это требует хирургического опыта и сильно ограничено в доставке в области, проксимальные к месту инъекции, что делает его непригодным для обычного клинического использования2. В доставке в мозг может также привести к прямой доставки мозга, минуя BBB, что позволяет для прямой и быстрой передачи различных веществ в мозг3,4. Эта передача, как полагают, происходят транспортные механизмы через обонятельные и тройничные нервы, которые соединяют носовой проход к мозгу, спинномозговой жидкости, и лимфатической системы5. Поскольку прямой маршрут «нос к мозгу» не включает периферийные органы и ткани, он существенно снижает системные побочные эффекты и улучшает потенцию. В администрации является перспективной неинвазивной альтернативой как местных, так и системных маршрутов для доставки мозга терапевтических агентов и может представлять собой мощный подход к борьбе с неврологическими расстройствами, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, и рак мозга, и в настоящее время изучается в нескольких клинических испытаниях6,7,8.
Некоторые экспериментальные факторы, такие как объем и метод прививки, а также рН формулировки, сильно влияют на доставку препарата в ЦНС через нос к мозгу путь9. В исследованиях с мышами, успех доставки препарата IN сильно зависит от правильного позиционирования головы, что имеет решающее значение для эффективного осаждения мозга и избежать утечки наркотиков во внешнюю среду или дыхательные пути. Примечательно, что большинство исследований грызунов использовать голову назад позиции (супина) с наклоном 70 “-90” для доставки препарата в обонятельный эпителий, даже если голова позиционирования на 0 “может способствовать дренаж в трахеи9. В доставке препаратов у мышей, которые бодрствуют приводит к уменьшению осаждения мозга по сравнению с любым применением в положении на спине, в основном из-за неспособности ученых держать мышей в нужном положении в течение более длительных периодов времени. Кроме того, перевернутое положение, требуемое методом сцепления кожи, используемым для бодрствующих мышей, приводит к осаждению препарата преимущественно в тройничном нерве и обонятельной лампе, а также периферических органах, таких как почки и легкие, в течение 30 минут постинокуляция10. Наиболее подходящим положением тела для доставки терапии через обонятельные или тройничные нервы у крупных животных, таких как нечеловеческие приматы в клинических исследованиях, как представляется, голова вниз и вперед позиции (т.е., так называемые “молитвы в Мекку положение”)11. Однако, это положение не было хорошо изучено в модели мыши, и положение на спине более широко используется в исследованиях грызунов.
Ранее мы показали, что RVG9R, пептид, разработанный на основе минимального рецептора связывающей области вируса бешенства, отображает тропизм к клеткам, выражающим никотиновые ацетилхолиновые рецепторы субъединиц, как нейроны и макрофаги и опосредует внутриклеточная доставка siRNA с помощью механизма, включающего вовлеченность рецепторов и временную делокализацию плазменной мембраны в месте агрегации рецепторов12,13. Важно отметить, что системное внутривенное введение комплексов РВГ9Р-сиРНК позволяет транссосудистую доставку сиРНК в ЦНС14. Тем не менее, системный маршрут разбавляет количество siRNA доставлены в ЦНС, и последние данные показывают, что IN администрации RVG9R:siRNA комплексов для мышей, расположенных в голову вниз и вперед позиции вызывает широко распространенный целевой ген нокдаун в несколько областей мозга15. Важно отметить, что этот уровень нокдауна был достигнут всего лишь 13,5 мкг siRNA вводят в течение четырех доз, 2 день режима в то время как IV маршрут требует 5 раз более высокую дозу за инъекцию для достижения сопоставимых нокдаун. Единственным недостатком подхода IN является то, что это трудная процедура, требующая использования обеих рук во время введения раствора, непрерывно сжимая мышей, альтернативно в голову вниз и вперед и в расслабленных позициях между каждое вдыхание в течение значительного длительного периода лечения (процедура 30-45 мин для эффективного поглощения объема 20-30 л на мышь). Использование мыши позиционирования устройство, представленное здесь позволяет надлежащее размещение мышей с небольшим физическим давлением на животных и персонала, выполняющего протокол, а также лечение нескольких когорты мышей в течение разумного периода времени, позволяет углубленное исследование по использованию siRNAs в качестве терапевтического для Западного Нила энцефалита у мышей на поздних стадиях заболевания15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы разработали устройство позиционирования мыши для оптимального позиционирования мышей для переноса терапии от носа к мозгу. Устройство оснащено различными функциональными возможностями, обеспечивая легкое одновременное обращение с животными. Он также оснащен грелкой для поддержания физиологических температур тела животных во время экспериментов. Обезоженных мышей можно поддерживать в голову вниз и вперед позиции с помощью специально разработанных стульев, с минимальным дискомфортом для животных. Высота позиционирования стулья могут быть скорректированы таким образом, как лучше визуализировать ноздри животных при приеме наркотиков.
В доставке мозга имеет несколько внутренних ограничений, в том числе небольшой площади поверхности ноздрей (позволяет максимальные объемы 20-30 л на администрацию), раздражение носа, повреждение эпителия, и ограниченное поглощение через носовой эпителий18. В администрации препаратов для мышей, помещенных в положение на спине был использован для доставки мозга путем сброса жидких препаратов в животных альтернативных nares через пипетку или полиуретановые трубки (24 G х 19 мм), подключенных к микролитровым шприцев19, 20. Хотя использование трубных систем для выпуска лекарств вблизи обонятельного эпителия является потенциально подходящим подходом, это вызывает раздражение или воспаление носа при повторном применении. Кроме того, небольшой размер полости носа ограничивает этот подход, особенно у мышей, которые могут быть преодолены путем повторения, а также лекарственные составы, которые сохраняются в слизистой оболочке носа. Другой вариант является IN администрации терапии бодрствовать мышей10. Однако этот подход требует квалифицированных процедур для обращения с животными во время прививки. Кроме того, он вызывает стресс животных и, следовательно, не идеально подходит для моделей заболеваний, особенно моделей инфекционных заболеваний. Кроме того, непоследовательная дозировка может легко возникнуть в результате дренажа наркотиков в легкие или желудок из-за несовершенства захвата животных. Представленный здесь подход позволяет ученым преодолеть эти технические барьеры. Голова вниз и вперед положение снижает возможность утечки наркотиков из носа в легкие при вдыхании, в пользу прямой и селективной доставки siRNA к мозгу. При доставке с помощью устройства позиционирования мыши не требуется какой-либо специализированной техники для обработки или захвата животных во время прививки. Четыре животных одновременно можно лечить в течение не менее 30-45 мин. Процедура может быть масштабирована путем включения дополнительных четырех стульев бар, что позволяет легко управления до восьми мышей в той же экспериментальной сессии. Таким образом, следуя этому методу, один оператор может вызвать доставку лекарств в мозг больших групп животных в течение длительных периодов времени.
Анатомическая структура носовой полости сильно влияет на родосную носк-мозг (как рассмотрено Merkus et al.11 и Ruigrok и de Lange21). Относительная площадь поверхности полости носа у мышей в 15 раз больше, чем у человека, а относительная площадь поверхности обонятельного эпителия в 6 раз больше. Хотя Существуют значительные различия в анатомии полости носа у людей к грызунам, Есть около 45 клинических испытаний в настоящее время с использованием подхода IN для лечения нескольких расстройств мозга (www.clinicaltrials.gov). Исследование, представленное здесь показывает, что при использовании In доставки терапии, ученые должны учитывать несколько факторов, таких как положение головы, сон, и надлежащие агенты доставки.
Мы показали эффективное и специфическое осаждение флуоресцентно помеченных siRNA к мозгу мыши. Кроме того, значительное снижение экспрессии генов SOD1, наблюдаемое после родов IN siRNA, подтвердило функциональные эффекты. Ранее мы последовательно показали, что IN администрации Комплексов RVG9R-siRNA ориентации вируса Западного Нила (WNV) РНК оказывает сильное терапевтическое воздействие на WNV энцефалит15. Примечательно, что родос к мозгу siRNA доставки требуется ячейки ориентации лиганда (RVG) и положительно заряженных молекул (9R) для сложных siRNA. При отсутствии этих элементов молекулы очищались через системную цепь и лимфатические сосуды 48 ч послеобработки(рисунок 3A)15. Таким образом, в экспериментальной установки, описанной здесь, мы изучили пептид / siRNA локализации 48 ч после прививки к изображению только уровни, сохраненные конкретно в головном мозге. Этот подход может быть легко реализован для доставки других молекул, таких как белки, пептиды и наночастицы, или другие терапевтические, для лечения ряда расстройств, связанных с мозгом.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Министерством здравоохранения и социального обеспечения Кореи (HI17C1046) компании S.K.L.
Materials
| Comercial assays | |||
| iScript cDNA synthesis kit | BioRad | Cat# 1708891 | |
| RNAiso plus | TaKaRa Bio | Cat# 9108 | |
| SYBR Premix ExTaq | TaKaRa Bio | Cat# RR420A | |
| Dyes | |||
| Alexa fluor 488 | ThermoFisher | Cat# A30052 | |
| Mouse strain | |||
| Balb/c | Orient Bio | N/A | 6-8 week old, 20-30g |
| Oligonucleotides and primers | |||
| Human CD4 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GAUCAAGAGACUCCUCAGU-3’ |
| siSOD1 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3’ |
| GAPDH primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3’ R: 5’-GGAGACAACCTGGTCCTCAG-3’ |
| SOD1 primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3’ R: 5’-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3’ |
| Peptides | |||
| RVG9R | Peptron | N/A | YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRRR |
| RVM9R | Peptron | N/A | MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRRRR |
| Software, algorithms and devices | |||
| FlowJo software 4.3 | FlowJO, LLC | N/A | http://docs.flowjo.com/vx/ |
| Mouse positioning device | Signet Biotech | N/A | |
| Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |
| Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |
References
- Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx. 2, 3-14 (2005).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. Journal of Visualized Experiments. (56), e2968 (2011).
- Khan, A. R., Liu, M., Khan, M. W., Zhai, G. Progress in brain targeting drug delivery system by nasal route. Journal of Controlled Release. 268, 364-389 (2017).
- Meredith, M. E., Salameh, T. S., Banks, W. A. Intranasal delivery of proteins and peptides in the treatment of neurodegenerative diseases. The AAPS Journal. 17, 780-787 (2015).
- Pardeshi, C. V., Belgamwar, V. S. Direct nose to brain drug delivery via integrated nerve pathways bypassing the blood-brain barrier: an excellent platform for brain targeting. Expert Opinion on Drug Delivery. 10, 957-972 (2013).
- Agrawal, M., et al. Nose-to-brain drug delivery: An update on clinical challenges and progress towards approval of anti-Alzheimer drugs. Journal of Controlled Release. 281, 139-177 (2018).
- Van Woensel, M., et al. Formulations for intranasal delivery of pharmacological agents to combat brain disease: a new opportunity to tackle GBM. Cancers. 5, 1020-1048 (2013).
- Kulkarni, A. D., et al. Nanotechnology-mediated nose to brain drug delivery for Parkinson’s disease: a mini review. Journal of Drug Targeting. 23, 775-788 (2015).
- Dhuria, S. V., Hanson, L. R., Frey, W. H. Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 99, 1654-1673 (2010).
- Hanson, L. R., Fine, J. M., Svitak, A. L., Faltesek, K. A. Intranasal administration of CNS therapeutics to awake mice. Journal of Visualized Experiments. (74), e4440 (2013).
- Merkus, P., Ebbens, F. A., Muller, B., Fokkens, W. J. Influence of anatomy and head position on intranasal drug deposition. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology and Head & Neck. 263, 827-832 (2006).
- Zeller, S., et al. Attachment of cell-binding ligands to arginine-rich cell-penetrating peptides enables cytosolic translocation of complexed siRNA. Chemistry & Biology. 22, 50-62 (2015).
- Kim, J., et al. Silencing CCR2 in macrophages alleviates adipose tissue inflammation and the associated metabolic syndrome in dietary obese mice. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 5, (2016).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39 (2007).
- Beloor, J., et al. Small interfering RNA-mediated control of virus replication in the CNS is therapeutic and enables natural immunity to West Nile virus. Cell Host & Microbe. 23, 549-556 (2018).
- Ullah, I., et al. Trileucine residues in a ligand-CPP-based siRNA delivery platform improve endosomal escape of siRNA. Journal of Drug Targeting. 25, 320-329 (2017).
- Yu, D., Li, G., Lesniak, M. S., Balyasnikova, I. V. Intranasal delivery of therapeutic stem cells to glioblastoma in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (124), e55845 (2017).
- Mittal, D., et al. Insights into direct nose to brain delivery: current status and future perspective. Drug Delivery. 21, 75-86 (2014).
- Renner, D. B., Frey, W. H., Hanson, L. R. Intranasal delivery of siRNA to the olfactory bulbs of mice via the olfactory nerve pathway. Neuroscience Letters. 513, 193-197 (2012).
- Serralheiro, A., Alves, G., Fortuna, A., Falcão, A. Intranasal administration of carbamazepine to mice: a direct delivery pathway for brain targeting. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 60, 32-39 (2014).
- Ruigrok, M. J., de Lange, E. C. Emerging insights for translational pharmacokinetic and pharmacokinetic-pharmacodynamic studies: towards prediction of nose-to-brain transport in humans. The AAPS Journal. 17, 493-505 (2015).
