ここでは、脳標的ペプチドsiRNA製剤の鼻腔内投与に対するマウスの適切な配置を可能にするマウス位置決め装置を用いて、中枢神経系における有効な遺伝子サイレンシングを可能にするプロトコルを提示する。
脳への鼻腔内(IN)薬物送達は、中枢神経系(CNS)への薬物の送達のための血液脳関門(BBB)をバイパスする有望な方法として出現した。最近の研究は、脳ウイルス糖タンパク質の最小受容体結合ドメインを組み込んだペプチドRVG9Rの使用を実証し、脳内のニューロンへのsiRNAの送達を引き出す。このプロトコルでは、ペプチド-siRNA製剤は、支配的な手にピペットを持つ内在として送達され、麻酔マウスは肺への排液を避けるために「頭の下と前方の位置」で非支配的な手でスクラフトによって拘束される。吸入時に胃を。マウスのこの正確なグリップは学ぶことができますが、容易ではなく、効果的なCNS取り込みをもたらすには練習とスキルが必要です。さらに、このプロセスは長引きであり、吸入当たり1〜2μL液量で〜20〜30μLの溶液の総体積の投与に約45分を要し、吸入の間に3〜4分の休息期間を要する。本研究の目的は、ペプチド-siRNA製剤の効率的なIN投与のためのマウスの適切な配置を可能にするマウス位置決め装置を開示することである。複数の機能がデバイスの設計に組み込まれており、調整可能な高さと傾斜を持つ4つまたは8つのポジショニングチェアが頭部の下向きの位置で麻酔されたマウスを拘束し、マウスのナレとマウスの容易な視覚化を可能にします。プロシージャの間にマウスの体温を維持するために作り付けの暖房パッド。重要なことは、この方法でRVG9R-siRNA複合体と同時に4〜8匹のマウスを治療する能力は、IN治療用siRNAアプローチの試験のために、はるかに速い時間スケールでの研究を可能にする。結論として、この装置は、RVG9R-siRNAおよびナノ粒子または抗体などの他の治療分子のIN適用のための適切で制御されたマウスヘッド位置決めをCNS送達のために可能にする。
BBBは、>400-600 Daの全身投与分子が脳に入るのを防ぎ、CNSおよび脳1に影響を与える疾患に対する治療生体分子の送達に重大な課題を提起する。脳への直接薬物送達は、定位注射によって達成することができる。しかし、これは外科的専門知識を必要とし、注射部位に近い領域への送達に非常に制限されており、日常的な臨床使用には不向きです2.脳へのIN送達はまた、BBBをバイパスすることによって直接脳送達をもたらし、脳3、4への様々な物質の直接的かつ迅速な移動を可能にする。この転移は、鼻の通路を脳、脳脊髄液、およびリンパ系5に接続する嗅覚および三叉神経を介した輸送機構によって起こると考えられている。直接の鼻から脳へのルートは末梢器官や組織を含まないため、全身的な副作用を実質的に減少させ、効力を向上させます。IN投与は、治療薬の脳送達のための局所的および全身的経路の両方に有望な非侵襲的な代替物であり、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびおよびを含む神経疾患と戦うための強力なアプローチを表すかもしれない。脳癌、およびいくつかの臨床試験6、7、8で探索されている。
接種量および接種方法、ならびに製剤pHなどのいくつかの実験因子は、鼻から脳への経路9を介したCNSへの薬物送達に強く影響を与える。マウスを用いた研究では、IN薬物送達の成功は、効率的な脳沈着のために重要であり、外部環境や気道への薬物の排液を避けるために重要である適切な頭部位置決めに強く依存する。特に、げっ歯類研究の大半は、0°での頭部位置が気管9への排水を好むかもしれないにもかかわらず、嗅覚上皮への薬物送達のための70°-90°傾きを持つヘッドバック位置(supine)を採用しています。目を覚ますマウスでの薬物のIN送達は、主に科学者が長期間、所望の位置にマウスを保持することができないため、スナシン位置の任意のアプリケーションと比較して、脳沈着が減少する結果をもたらす。さらに、覚醒マウスに用いられる皮膚グリップ法で必要とされる逆さまの位置は、主に三叉神経と嗅球、ならびに腎臓や肺などの末梢器官に30分以内に薬物沈着をもたらす。接種後 10.臨床研究における非ヒト霊長類のような大きな動物における嗅覚または三叉神経を介した治療の送達に最も適切な身体位置は、頭部の下向きの位置であるように見える(すなわち、いわゆる「メッカへの祈り」)位置”)11.しかし、この位置はマウスモデルではよく研究されておらず、げっ歯類の研究では上の位置がより広く使用されています。
以前に、RVG9Rは、狂犬病ウイルスの最小受容体結合ドメインに基づいて設計されたペプチドが、ニューロンやマクロファージのようなニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットを発現する細胞に対して栄養を表示し、受容体凝集部位における受容体関与および一時的な血漿膜脱局性を伴うメカニズムによるsiRNAの細胞内送達12,13.重要なことに、RVG9R-siRNA複合体の全身静脈内投与は、CNS14へのsiRNAの血管送達を可能にする。しかし、全身経路はCNSに送達されるsiRNAの量を希釈し、最近のデータは、頭部の下向き位置に位置するマウスに対するRVG9R:siRNA複合体のIN投与が広範囲に及ぶ標的遺伝子ノックダウンを引き起こしていることを示している。脳の複数の領域15.重要なことに、このレベルのノックダウンは、IVルートが同等のノックダウンを達成するために注射当たり約5倍の高用量を必要とする一方で、4回投与、2日間のレジメンで投与されたsiRNAのわずか13.5 μgで達成された。INアプローチの唯一の欠点は、それが困難な手順であり、溶液の投与中に両手を使用する必要がある一方で、マウスを頭の下から前方に連続的につかみ、間のリラックスした位置で交互につかむことです。かなりの長い処置期間のための各吸入(マウスごとの〜20-30 μL容積の有効な取り込みのための30-45分のプロシージャ)。ここで提示したマウスポジショニング装置を使用することで、動物やプロトコルを実行する担当者に対する身体的な取り組みがほとんどないマウスの適切な配置と、合理的な期間内にマウスの複数のコホートの治療を行うことが可能となり、疾患15の後期段階におけるマウスにおける西ナイル脳炎の治療薬としてsiRNAを使用する詳細な研究を可能にする。
治療薬の鼻から脳への送達に最適な位置決めを行うマウス位置決め装置を開発した。装置は異なった機能が装備され、動物の容易な同時処理を保障する。それはまた実験の間に動物の生理的な体温の維持のための暖房パッドが装備されている。麻酔マウスは、動物に対する不快感を最小限に抑えながら、特別に設計された椅子によって頭部を下向きの位置に維持することができる。ポジショニングチェアの高さは、薬物を投与しながら動物の鼻孔を視覚化するのが最善であるような方法で調整することができます。
脳の送達には、鼻孔の小さな表面積(投与当たり20〜30μLの最大容積を可能にする)、鼻刺激、上皮損傷、および鼻上皮18にわたる限られた吸収を含むいくつかの固有の制限がある。サピン位置に置かれたマウスに対する薬物のIN投与は、マイクロリットル注射器19に接続されたピペットまたはポリウレタンチューブ(24G x 19 mm)を介して動物の代替ナレに液体薬を投下することによって脳送達に使用されてきた、20.嗅上皮付近の薬物を放出するチューブシステムの使用は潜在的に適切なアプローチであるが、反復投与時に刺激または鼻炎を引き起こす。さらに、鼻腔の小さなサイズは、このアプローチを制限し、特に繰り返しによって克服されうるマウス、ならびに鼻粘膜に持続する薬物製剤によって。別のオプションは、マウス10を目覚めさせる治療薬のIN投与である。しかし、このアプローチは、IN接種中の動物の取り扱いに熟練した手順を必要とします。さらに、それは動物のストレスを引き起こすので、疾患モデル、特に感染症モデルには理想的ではありません。さらに、一貫性のない投薬は、不完全な動物のつかみによる肺または胃への薬物の排液から容易に生じ得る。ここで提示されるアプローチは、科学者がこれらの技術的な障壁を克服することを可能にします。頭部の下向きの位置は吸入している間鼻から肺への薬物漏出の可能性を減らし、脳への直接および選択的なsiRNAの配達を好む。マウス位置決め装置を用いたIN送達は、接種中に動物を取り扱ったりつかんだりするための特殊な技術を必要としない。一度に4匹の動物を少なくとも30〜45分間治療することができる。プロシージャは付加的な4椅子の棒を含めることによってスケールアップすることができ、同じ実験セッションの8匹までのマウスの容易な管理を可能にする。したがって、この方法に従って、単一のオペレータは、長期間にわたって動物の大規模なグループの脳への薬物送達を誘導してもよい。
鼻腔の解剖学的構造は、鼻から脳への送達に強く影響を与える(Merkus et al.11およびRuigrokおよびde Lange21によってレビューされた)。マウスの鼻腔の相対表面積はヒトの15倍、嗅上皮の相対表面積は6倍大きい。ヒトの鼻腔の解剖学にはげっ歯類に大きな違いがありますが、いくつかの脳障害を治療するためにINアプローチを使用して約45の臨床試験が進行中です(www.clinicaltrials.gov)。ここで提示された研究は、治療薬のIN送達を使用する場合、科学者は、頭部位置、睡眠、および適切な送達剤などのいくつかの要因を考慮する必要があることを示しています。
マウス脳に蛍光標識siRNAの効率的かつ特異的な沈着を示した。さらに、IN siRNA送達後に観察されたSOD1遺伝子発現の有意な減少は機能的効果を確認した。我々は以前、西ナイルウイルス(WNV)RNAを標的とするRVG9R-siRNA複合体のIN投与がWNV脳炎15に対して強い治療効果を発揮することを一貫して示した。特に、鼻から脳へのsiRNA送達には、細胞標的リガンド(RVG)と正に帯電した分子(9R)が必要でした。これらの元素が存在しない場合、分子は全身回路およびリンパ管48h後処理(図3A)15を介してクリアされた。そこで、ここで説明する実験セットアップでは、接種後48時間のペプチド/siRNA局在化を調べ、脳内に特異的に保持されたレベルのみを画像化した。このアプローチは、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子、または他の治療薬などの他の分子の送達のために、多くの脳関連障害の治療のために容易に実施することができる。
The authors have nothing to disclose.
この作業は、韓国保健福祉省(HI17C1046)がS.K.L.に支援しました。
Comercial assays | |||
iScript cDNA synthesis kit | BioRad | Cat# 1708891 | |
RNAiso plus | TaKaRa Bio | Cat# 9108 | |
SYBR Premix ExTaq | TaKaRa Bio | Cat# RR420A | |
Dyes | |||
Alexa fluor 488 | ThermoFisher | Cat# A30052 | |
Mouse strain | |||
Balb/c | Orient Bio | N/A | 6-8 week old, 20-30g |
Oligonucleotides and primers | |||
Human CD4 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GAUCAAGAGACUCCUCAGU-3’ |
siSOD1 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3’ |
GAPDH primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3’ R: 5’-GGAGACAACCTGGTCCTCAG-3’ |
SOD1 primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3’ R: 5’-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3’ |
Peptides | |||
RVG9R | Peptron | N/A | YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRRR |
RVM9R | Peptron | N/A | MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRRRR |
Software, algorithms and devices | |||
FlowJo software 4.3 | FlowJO, LLC | N/A | http://docs.flowjo.com/vx/ |
Mouse positioning device | Signet Biotech | N/A | |
Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |
Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |