Qui, presentiamo un protocollo utilizzando un dispositivo di posizionamento del mouse che consente il posizionamento appropriato dei topi per la somministrazione intranasale di una formulazione di peptidi-siRNA mirata al cervello che consente un silenziamento genico efficace nel sistema nervoso centrale.
La somministrazione di farmaci intranasali (IN) al cervello è emersa come un metodo promettente per aggirare la barriera emato-encefalica (BBB) per la somministrazione di farmaci nel sistema nervoso centrale (SNC). Recenti studi dimostrano l’uso di un peptide, RVG9R, incorporando il dominio minimo di legame recettore della glicoproteina del virus rabies, nell’insorgere la consegna di siRNA nei neuroni nel cervello. In questo protocollo, la formulazione del peptide-siRNA viene consegnata intranasalmente con una pipetta nella mano dominante, mentre il topo anestetica viene trattenuto dalla mischia con la mano non dominante in una “testa in basso e in avanti” per evitare il drenaggio nel polmone e stomaco dopo l’inalazione. Questa presa precisa di topi può essere appresa, ma non è facile e richiede pratica e abilità per portare a un efficace assorbimento del SNC. Inoltre, il processo è a lungo disegnato, richiedendo circa 45 min per l’amministrazione di un volume totale di 20-30 dollari l di soluzione in 1-2 volumi di gocciolina per inalazione, con 3-4 min di periodi di riposo tra ogni inalazione. L’obiettivo di questo studio è quello di rivelare un dispositivo di posizionamento del mouse che consente il posizionamento appropriato dei topi per una somministrazione efficiente della formulazione di peptide-siRNA. Molteplici caratteristiche sono incorporate nel design del dispositivo, come quattro o otto sedie di posizionamento con altezza e inclinazione regolabili per frenare i topi anestesizzati nella posizione della testa verso il basso e in avanti, consentendo una facile visualizzazione delle noci dei topi e cuscinetto di riscaldamento integrato per mantenere le temperature corporee dei topi durante la procedura. È importante sottolineare che la capacità di trattare quattro o otto topi contemporaneamente con complessi RVG9R-siRNA in questo modo consente studi su una scala temporale molto più veloce, per la sperimentazione di un approccio siRNA terapeutico IN. In conclusione, questo dispositivo consente un posizionamento appropriato e controllato della testa del topo per l’applicazione IN del siRNA RVG9R e di altre molecole terapeutiche, come nanoparticelle o anticorpi, per la somministrazione del SNC.
Il BBB impedisce alle molecole somministrate sistemicamente di >400-600 Da di entrare nel cervello, ponendo una sfida significativa per la consegna di biomolecole terapeutiche per malattie che colpiscono il SNC e il cervello1. La somministrazione diretta di farmaci al cervello può essere ottenuta mediante iniezione stereotassica; tuttavia, questo richiede esperienza chirurgica ed è altamente limitato nella consegna ad aree prossimali al sito di iniezione, rendendolo inadatto per l’uso clinico di routine2. IN consegna al cervello può anche provocare la consegna diretta del cervello bypassando il BBB, consentendo il trasferimento diretto e rapido di una varietà di sostanze al cervello3,4. Questo trasferimento è pensato per avvenire dai meccanismi di trasporto attraverso i nervi olfattivi e trigeminici che collegano il passaggio nasale al cervello, il liquido cerebrospinale e i sistemi linfatici5. Poiché il percorso diretto naso-cervello non coinvolge organi e tessuti periferici, riduce sostanzialmente gli effetti collaterali sistemici e migliora la potenza. La somministrazione in sede è una promettente alternativa non invasiva alle vie locali e sistemiche per la fornitura di agenti terapeutici e può rappresentare un potente approccio per combattere i disturbi neurologici, tra cui il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson e cancro al cervello, ed è in fase di esplorazione in diversi studi clinici6,7,8.
Diversi fattori sperimentali, come il volume e il metodo di inoculazione, così come il pH di formulazione, influenzano fortemente la somministrazione di farmaci al SNC attraverso il percorso naso-cervello9. Negli studi con i topi, il successo della somministrazione di farmaci IN dipende fortemente dal corretto posizionamento della testa, che è fondamentale per una deposizione efficiente del cervello ed evitare il drenaggio dei farmaci nell’ambiente esterno o nelle vie aeree. In particolare, la maggior parte degli studi sui roditori impiegano una posizione di testa-indietro (supina) con un’inclinazione di 70-90 gradi per la somministrazione di farmaci all’epitelio olfattivo, anche se il posizionamento della testa a 0 o può favorire il drenaggio nella trachea9. Nella somministrazione di farmaci nei topi che sono svegli si traduce in una deposizione cerebrale ridotta rispetto a qualsiasi applicazione nella posizione supina, principalmente a causa dell’incapacità degli scienziati di tenere i topi nella posizione desiderata per lunghi periodi di tempo. Inoltre, la posizione capovolta richiesta dal metodo di impugnatura cutanea impiegato per i topi svegli provoca una deposizione di farmaci prevalentemente nel nervo trigemino e nel bulbo olfattivo, nonché negli organi periferici, come reni e polmoni, entro 30 min postinoculazione10. La posizione del corpo più appropriata per la somministrazione di terapie attraverso i nervi olfattivi o trigemini in animali più grandi come i primati non umani negli studi clinici sembra essere la posizione di testa in basso e in avanti (cioè, la cosiddetta “preghiera alla Mecca posizione”)11. Tuttavia, questa posizione non è stata ben studiata nel modello del mouse, e la posizione supina è più ampiamente utilizzata negli studi sui roditori.
In precedenza, abbiamo dimostrato che il RVG9R, un peptide progettato sulla base del dominio di legame recettore minimo del virus della rabbia, mostra il tropismo alle cellule che esprimono sottounità di recettori dell’acetilcolina nicotinica come neuroni e macrofagi e media consegna intracellulare di siRNA mediante un meccanismo che coinvolge l’impegno del recettore e la delocalizzazione temporanea della membrana plasmatica nel sito dell’aggregazione del recettore12,13. È importante sottolineare che la somministrazione endovenosa sistemica dei complessi RVG9R-siRNA consente la somministrazione transvascolare di siRNA nel CNS14. Tuttavia, la rotta sistemica diluisce la quantità di siRNA consegnata al SNC, e dati recenti dimostrano che la gestione IN dei complessi RVG9R:siRNA ai topi posizionati nella posizione della testa verso il basso e in avanti suscita un knockdown genico bersaglio diffuso più regioni del cervello15. È importante sottolineare che questo livello di knockdown è stato raggiunto con appena 13,5 g di siRNA somministrati su un regime di quattro dosi, 2 giorni mentre il percorso IV richiede una dose 5 volte superiore per iniezione per ottenere un knockdown comparabile. L’unico difetto dell’approccio IN è che si tratta di una procedura ardua, che richiede l’uso di entrambe le mani durante la somministrazione della soluzione, mentre afferra continuamente i topi in alternativa nella testa verso il basso e in avanti e in posizioni rilassate tra inalazione per un periodo di trattamento prolungato (una procedura di 30-45 min per l’effettiva assunzione di un volume da 20 a 30 dollari per topo). L’utilizzo del dispositivo di posizionamento del mouse qui presentato consente il corretto posizionamento dei topi con poca costrizione fisica agli animali e al personale che esegue il protocollo, nonché il trattamento di più coorti di topi entro un periodo di tempo ragionevole, consentendo uno studio approfondito sull’utilizzo dei siRNA come terapia per l’encefalite del Nilo occidentale nei topi nelle fasi tardive della malattia15.
Abbiamo sviluppato un dispositivo di posizionamento del mouse per posizionare in modo ottimale i topi per la somministrazione da naso a cervello delle terapie. Il dispositivo è dotato di diverse funzionalità, garantendo la facile manipolazione simultanea degli animali. È inoltre dotato di cuscinetti riscaldanti per il mantenimento delle temperature fisiologiche del corpo degli animali durante la sperimentazione. I topi anestesizzati possono essere mantenuti nella posizione della testa verso il basso e in avanti per mezzo di sedie appositamente progettate, con il minimo disagio per gli animali. L’altezza delle sedie di posizionamento può essere regolata in modo tale da poter visualizzare le narici animali durante la somministrazione di farmaci.
In la somministrazione cerebrale ha diverse limitazioni intrinseche, tra cui la piccola superficie delle narici (che consente volumi massimi di 20-30 L per somministrazione), irritazione nasale, danni all’epitelio e assorbimento limitato attraverso l’epitelio nasale18. La somministrazione di farmaci ai topi posizionati nella posizione supina è stata utilizzata per la somministrazione del cervello facendo cadere farmaci liquidi nelle nare alternative degli animali tramite pipetta o tubi in poliuretano (24 G x 19 mm) collegati a siringhe microliter19, 20.Sebbene l’uso di sistemi di tubazione per rilasciare farmaci vicino all’epitelio olfattivo sia un approccio potenzialmente adatto, provoca irritazione o infiammazione nasale dopo la somministrazione ripetitiva. Inoltre, le piccole dimensioni della cavità nasale limitano questo approccio, soprattutto nei topi che possono essere superati ripetendo, così come dalle formulazioni farmacologiche che persistono nella mucosa nasale. Un’altra opzione è la somministrazione di terapie ai topi svegli10. Tuttavia, questo approccio richiede procedure qualificate per la movimentazione degli animali durante l’inoculazione dell’INoculazione. Inoltre, provoca stress animale e, quindi, non è ideale per i modelli di malattia, in particolare i modelli di malattia infettiva. Inoltre, il dosso incoerente può facilmente derivare dal drenaggio della droga nei polmoni o nello stomaco a causa di impugnatura animale imperfetta. L’approccio qui presentato consente agli scienziati di superare queste barriere tecniche. La posizione della testa verso il basso e in avanti riduce la possibilità di fuoriuscita di farmaci dal naso ai polmoni durante l’inalazione, favorendo la consegna diretta e selettiva del siRNA al cervello. IN consegna utilizzando il dispositivo di posizionamento del mouse non richiede alcuna tecnica specializzata per la manipolazione o afferrare gli animali durante l’inoculazione. Quattro animali alla volta possono essere trattati per un periodo di almeno 30-45 min. La procedura può essere scalata includendo una barra a quattro sedie supplementare, consentendo una facile gestione di un massimo di otto topi nella stessa sessione sperimentale. Pertanto, seguendo questo metodo, un singolo operatore può indurre la somministrazione di farmaci al cervello di grandi gruppi di animali per lunghi periodi di tempo.
La struttura anatomica della cavità nasale influenza fortemente la consegna naso-cervello (come recensito da Merkus et al.11 e Ruigrok e de Lange21). La superficie relativa della cavità nasale nei topi è 15 volte più grande di quella degli esseri umani e la superficie relativa dell’epitelio olfattivo è 6 volte più grande. Anche se ci sono differenze significative nell’anatomia della cavità nasale negli esseri umani ai roditori, ci sono circa 45 studi clinici in corso utilizzando l’approccio IN per il trattamento di diversi disturbi cerebrali (www.clinicaltrials.gov). Lo studio qui presentato indica che quando si utilizza la consegna IN di terapie, gli scienziati dovrebbero prendere in considerazione diversi fattori, come la posizione della testa, dormire, e agenti di consegna adeguati.
Abbiamo mostrato la deposizione efficiente e specifica di siRNA fluorescente al cervello del topo. Inoltre, la diminuzione significativa nell’espressione genica di SOD1 osservata dopo che la somministrazione di SIRNA ha confermato gli effetti funzionali. In precedenza abbiamo dimostrato in modo coerente che la somministrazione DI complessi RVG9R-siRNA mirati all’RNA del virus del Nilo Occidentale (WNV) esercita un forte effetto terapeutico sull’encefalite WNV15. In particolare, la somministrazione di siRNA da naso a cervello richiedeva un ligando mirante alle cellule (RVG) e una molecola carica positivamente (9R) a siRNA complessi. In assenza di questi elementi, le molecole sono state sgomberate attraverso il circuito sistemico e i vasi linfatici 48 h dopo il trattamento (Figura 3A)15. Pertanto, nella configurazione sperimentale descritta qui, abbiamo esaminato la localizzazione di peptidi/siRNA 48 h dopo l’inoculazione per l’immagine solo i livelli mantenuti specificamente nel cervello. Questo approccio potrebbe essere facilmente implementato per la consegna di altre molecole, come proteine, peptidi e nanoparticelle, o altre terapie, per il trattamento di una serie di disturbi correlati al cervello.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero della Salute & Welfare della Corea (HI17C1046) a S.K.L.
Comercial assays | |||
iScript cDNA synthesis kit | BioRad | Cat# 1708891 | |
RNAiso plus | TaKaRa Bio | Cat# 9108 | |
SYBR Premix ExTaq | TaKaRa Bio | Cat# RR420A | |
Dyes | |||
Alexa fluor 488 | ThermoFisher | Cat# A30052 | |
Mouse strain | |||
Balb/c | Orient Bio | N/A | 6-8 week old, 20-30g |
Oligonucleotides and primers | |||
Human CD4 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GAUCAAGAGACUCCUCAGU-3’ |
siSOD1 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3’ |
GAPDH primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3’ R: 5’-GGAGACAACCTGGTCCTCAG-3’ |
SOD1 primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3’ R: 5’-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3’ |
Peptides | |||
RVG9R | Peptron | N/A | YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRRR |
RVM9R | Peptron | N/A | MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRRRR |
Software, algorithms and devices | |||
FlowJo software 4.3 | FlowJO, LLC | N/A | http://docs.flowjo.com/vx/ |
Mouse positioning device | Signet Biotech | N/A | |
Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |
Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |