Ici, nous présentons un protocole utilisant un dispositif de positionnement de souris qui permet le placement approprié des souris pour l’administration intranasale d’une formulation de peptide-siRNA de cerveau-ciblage permettant le silençage efficace de gène dans le système nerveux central.
L’administration intranasale (IN) de médicaments au cerveau est apparue comme une méthode prometteuse pour contourner la barrière hémato-encéphalique (BBB) pour l’administration de médicaments dans le système nerveux central (SNC). Des études récentes démontrent l’utilisation d’un peptide, RVG9R, incorporant le domaine récepteur-contraignant minimal de la glycoprotéine de virus de la rage, en obtenant la livraison de siRNA dans les neurones dans le cerveau. Dans ce protocole, la formulation peptide-siRNA est livrée intranasally avec une pipette dans la main dominante, tandis que la souris anesthésié est retenue par le éraflure avec la main non dominante dans une « position de tête vers le bas et vers l’avant » pour éviter le drainage dans le poumon et l’estomac à l’inhalation. Cette préhension précise des souris peut être apprise mais n’est pas facile et exige la pratique et la compétence pour avoir comme conséquence l’utilisation efficace de CNS. En outre, le processus est tiré à long terme, nécessitant environ 45 min pour l’administration d’un volume total de 20-30 l de solution en 1-2 volumes de gouttelettes llet par inhalation, avec 3-4 min de périodes de repos entre chaque inhalation. L’objectif de cette étude est de divulguer un dispositif de positionnement de la souris qui permet le placement approprié des souris pour une administration efficace IN de la formulation peptide-siRNA. Plusieurs caractéristiques sont incorporées dans la conception de l’appareil, telles que quatre ou huit chaises de positionnement avec la hauteur réglable et l’inclinaison pour retenir les souris anesthésiés dans la position de tête vers le bas et vers l’avant, permettant une visualisation facile des nares des souris et un coussin chauffant intégré pour maintenir la température corporelle des souris pendant la procédure. Fait important, la capacité de traiter quatre ou huit souris simultanément avec des complexes RVG9R-siRNA de cette manière permet des études sur une échelle de temps beaucoup plus rapide, pour l’essai d’une approche in thérapeutique siRNA. En conclusion, ce dispositif permet un positionnement approprié et contrôlé de la tête de la souris pour l’application IN de RVG9R-siRNA et d’autres molécules thérapeutiques, telles que les nanoparticules ou les anticorps, pour la livraison du SNC.
Le BBB empêche les molécules administrées par le système de 400-600 Da d’entrer dans le cerveau, posant un défi important à la livraison de biomolécules thérapeutiques pour les maladies affectant le SNC et le cerveau1. L’administration directe de médicaments au cerveau peut être obtenue par injection stéréotaxique; cependant, ceci exige l’expertise chirurgicale et est fortement limité dans la livraison aux secteursproximal au site d’injection, le rendant impropre à l’usage clinique courant 2. Dans la livraison au cerveau peut également entraîner la livraison directe du cerveau en contournant le BBB, permettant le transfert direct et rapide d’une variété de substances au cerveau3,4. Ce transfert est pensé pour se produire par les mécanismes de transport par l’intermédiaire des nerfs olfactifs et trigéminaux qui relient le passage nasal au cerveau, le fluide céphalo-rachidien, et les systèmes lymphatiques5. Comme la route directe du nez au cerveau n’implique pas les organes et les tissus périphériques, elle réduit considérablement les effets secondaires systémiques et améliore la puissance. IN administration est une alternative non invasive prometteuse aux voies locales et systémiques pour la livraison du cerveau des agents thérapeutiques et peut représenter une approche puissante pour combattre les troubles neurologiques, y compris la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, et cancer du cerveau, et est à l’étude dans plusieurs essais cliniques6,7,8.
Plusieurs facteurs expérimentaux, tels que le volume et la méthode d’inoculation, ainsi que le pH de formulation, influencent fortement l’administration de médicaments au SNC par la voie nez-cerveau9. Dans les études sur des souris, le succès de l’administration de médicaments IN dépend fortement d’un bon positionnement de la tête, ce qui est essentiel pour un dépôt cérébral efficace et pour éviter le drainage des médicaments dans l’environnement externe ou les voies respiratoires. Notamment, la majorité des études de rongeurs emploient une position de tête-arrière (supine) avec une inclinaison de 70-90 degrés pour la livraison dedrogue à l’épithélium olfactif, même si le positionnement de tête à 0 degrés peut favoriser le drainage dans la trachée 9. DANS la livraison de médicaments chez les souris qui sont éveillés entraîne une réduction des dépôts cérébraux par rapport à toute application dans la position de supine, principalement en raison de l’incapacité des scientifiques à tenir les souris dans la position désirée pendant de plus longues périodes de temps. En outre, la position à l’envers requise par la méthode d’adhérence de la peau utilisée pour les souris éveillées entraîne un dépôt de médicaments principalement dans le nerf trigéninal et l’ampoule olfactive, ainsi que les organes périphériques, tels que les reins et les poumons, dans les 30 minutes postinoculation10. La position du corps la plus appropriée pour la livraison de produits thérapeutiques par le biais des nerfs olfactifs ou trigéminaux chez les grands animaux tels que les primates non humains dans les études cliniques semble être la position de tête vers le bas et vers l’avant (c.-à-d., la soi-disant «prier à la Mecque position”)11. Cependant, cette position n’a pas été bien étudiée dans le modèle de souris, et la position de supine est plus largement utilisée dans les études de rongeur.
Auparavant, nous avons montré que le RVG9R, un peptide conçu sur la base du domaine de liaison des récepteurs minimaux du virus de la rage, affiche le tropisme aux cellules exprimant des sous-unités de récepteurs d’acétylcholine nicotiniques comme les neurones et les macrophages et livraison intracellulaire de siRNA par un mécanisme impliquant l’engagement de récepteur et la délocalisation temporaire de membrane de plasma au site de l’agrégation de récepteur12,13. Fait important, l’administration intraveineuse systémique des complexes RVG9R-siRNA permet la livraison transvasculaire de siRNA dans le CNS14. Cependant, la voie systémique dilue la quantité de siRNA livrée au SNC, et des données récentes démontrent que l’administration IN des complexes RVG9R:siRNA aux souris positionnées dans la position de tête vers le bas et vers l’avant suscite un renversement de gène cible largement répandu dans plusieurs régions du cerveau15. Fait important, ce niveau de knockdown a été atteint avec aussi peu que 13,5 g de siRNA administré s’il s’agit d’un régime de quatre doses et de 2 jours, tandis que l’itinéraire IV nécessite une dose de 5 fois plus élevée par injection pour atteindre un knockdown comparable. La seule lacune de l’approche IN est qu’il s’agit d’une procédure ardue, nécessitant l’utilisation des deux mains lors de l’administration de la solution tout en saisissant continuellement les souris alternativement dans la tête vers le bas et vers l’avant et dans des positions détendues entre chaque inhalation pendant une longue période de traitement considérable (une procédure de 30-45 minutes pour l’utilisation effective d’un volume de 20-30 Livres par souris). L’utilisation du dispositif de positionnement de la souris présenté ici permet le placement approprié des souris avec peu de contrainte physique pour les animaux et le personnel exécutant le protocole, ainsi que le traitement de plusieurs cohortes de souris dans un délai raisonnable, permettant une étude approfondie sur l’utilisation des siARN comme thérapeutique pour l’encéphalite du Nil occidental chez la souris aux stades avancés de la maladie15.
Nous avons développé un dispositif de positionnement de souris pour positionner de manière optimale les souris pour la livraison du nez au cerveau des produits thérapeutiques. L’appareil est équipé de différentes fonctionnalités, assurant la manipulation simultanée facile des animaux. Il est également équipé de coussins chauffants pour le maintien de la température physiologique du corps des animaux pendant l’expérimentation. Les souris anesthésiées peuvent être maintenues dans la position de tête vers le bas et vers l’avant au moyen de chaises spécialement conçues, avec un minimum d’inconfort pour les animaux. La hauteur des chaises de positionnement peut être ajustée de manière à visualiser les narines animales tout en administrant des médicaments.
Dans la livraison du cerveau a plusieurs limitations intrinsèques, y compris la petite surface des narines (permettant des volumes maximaux de 20-30 L par administration), irritation nasale, dommages à l’épithélium, et l’absorption limitée à travers l’épithélium nasal18. L’administration IN de médicaments aux souris placées en position de supine a été utilisée pour la livraison du cerveau en laissant tomber des médicaments liquides dans les nares alternatives des animaux via pipette ou tube de polyuréthane (24 G x 19 mm) relié s’il y a des seringues de microlitre19, 20. Bien que l’utilisation de systèmes de tuyauterie pour libérer des drogues près de l’épithélium olfactif soit une approche potentiellement appropriée, elle cause l’irritation ou l’inflammation nasale sur l’administration répétitive. En outre, la petite taille de la cavité nasale limite cette approche, en particulier chez les souris qui peuvent être surmontées par la répétition, ainsi que par des formulations de médicaments qui persistent dans la muqueuse nasale. Une autre option est l’administration IN de la thérapeutique pour réveiller les souris10. Cependant, cette approche exige des procédures habiles pour la manipulation des animaux pendant l’inoculation IN. En outre, il provoque le stress animal et, par conséquent, n’est pas idéal pour les modèles de maladies, en particulier les modèles de maladies infectieuses. En outre, le dosage incohérent peut facilement résulter du drainage de drogue dans les poumons ou l’estomac dû à l’apaisement imparfait d’animal. L’approche présentée ici permet aux scientifiques de surmonter ces obstacles techniques. La position de tête vers le bas et vers l’avant réduit la possibilité de fuite de drogue du nez aux poumons tout en inhalant, favorisant la livraison directe et sélective de siRNA au cerveau. Dans la livraison à l’aide du dispositif de positionnement de la souris ne nécessite aucune technique spécialisée pour la manipulation ou la préhension des animaux pendant l’inoculation. Quatre animaux à la fois peuvent être traités pendant une période d’au moins 30-45 min. La procédure peut être mise à l’échelle en incluant une barre supplémentaire de quatre chaises, permettant la gestion facile de jusqu’à huit souris dans la même session expérimentale. Par conséquent, suivant cette méthode, un seul opérateur peut induire la livraison de médicaments au cerveau de grands groupes d’animaux sur de longues périodes de temps.
La structure anatomique de la cavité nasale influence fortement la livraison du nez au cerveau (tel qu’examiné par Merkus et al.11 et Ruigrok et de Lange21). La surface relative de la cavité nasale chez la souris est 15 fois plus grande que celle des humains et la surface relative de l’épithélium olfactif est 6 fois plus grande. Bien qu’il existe des différences significatives dans l’anatomie de la cavité nasale chez l’homme aux rongeurs, il ya environ 45 essais cliniques en cours en utilisant l’approche IN pour traiter plusieurs troubles cérébraux (www.clinicaltrials.gov). L’étude présentée ici indique que lors de l’utilisation de la livraison IN de la thérapeutique, les scientifiques devraient tenir compte de plusieurs facteurs, tels que la position de la tête, le sommeil, et les agents de livraison appropriés.
Nous avons montré le dépôt efficace et spécifique de siRNA étiqueté fluorescent au cerveau de souris. En outre, la diminution significative de l’expression de gène de SOD1 observée après que la livraison de siRNA ait confirmé des effets fonctionnels. Nous avons précédemment montré uniformément que l’administration IN des complexes rvG9R-siRNA ciblant l’ARN de virus du Nil occidental (WNV) exerce un effet thérapeutique fort sur l’encéphalite de WNV15. Notamment, la livraison de siRNA nez-à-cerveau a exigé un ligand de cellule-ciblage (RVG) et une molécule positivement chargée (9R) à l’ARNs complexe. En l’absence de ces éléments, les molécules ont été effacées par le circuit systémique et les vaisseaux lymphatiques 48 h posttraitement (Figure 3A)15. Par conséquent, dans la configuration expérimentale décrite ici, nous avons examiné la localisation de peptide/siRNA 48 h après l’inoculation pour imager seulement les niveaux retenus spécifiquement dans le cerveau. Cette approche pourrait être facilement mise en œuvre pour la livraison d’autres molécules, telles que les protéines, les peptides et les nanoparticules, ou d’autres thérapies, pour le traitement d’un certain nombre de troubles liés au cerveau.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par le Ministère coréen de la Santé et du Bien-être social (HI17C1046) à S.K.L.
Comercial assays | |||
iScript cDNA synthesis kit | BioRad | Cat# 1708891 | |
RNAiso plus | TaKaRa Bio | Cat# 9108 | |
SYBR Premix ExTaq | TaKaRa Bio | Cat# RR420A | |
Dyes | |||
Alexa fluor 488 | ThermoFisher | Cat# A30052 | |
Mouse strain | |||
Balb/c | Orient Bio | N/A | 6-8 week old, 20-30g |
Oligonucleotides and primers | |||
Human CD4 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GAUCAAGAGACUCCUCAGU-3’ |
siSOD1 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3’ |
GAPDH primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3’ R: 5’-GGAGACAACCTGGTCCTCAG-3’ |
SOD1 primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3’ R: 5’-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3’ |
Peptides | |||
RVG9R | Peptron | N/A | YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRRR |
RVM9R | Peptron | N/A | MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRRRR |
Software, algorithms and devices | |||
FlowJo software 4.3 | FlowJO, LLC | N/A | http://docs.flowjo.com/vx/ |
Mouse positioning device | Signet Biotech | N/A | |
Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |
Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |