JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

القسطرة الخفيفة داخل القلب للإشعال الجانبي لرصد الأيض الخلوي باستخدام مطياف الامتصاص عبر الجدارية لقلوب الثدييات المنصهرة

Published: May 12, 2019
doi:
10.3791/58992
, ,
1Laboratory of Cardiac Energetics, National Heart, Lung, and Blood Institute,National Institutes of Health, 2Department of Biomedical Engineering,The George Washington University

Summary

هنا نقدم طريقة لاستخدام القسطرة البصرية داخل البطين في القلوب المنصهرة لإجراء مطياف الامتصاص عبر جدار القلب. توفر البيانات التي تم الحصول عليها معلومات قوية عن توتر الأكسجين في الأنسجة، فضلا عن استخدام الركيزة وإمكانات الغشاء في وقت واحد مع مقاييس أداء القلب في هذا الإعداد في كل مكان.

Abstract

يوفر التحليل الطيفي لامتصاص عضلة القلب تقييمًا غير مدمر للأكسجين السيتوسي والميتوكوندريا عن طريق الميوغلوبين وامتصاص السيتوكروم على التوالي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا تقدير العديد من جوانب الوضع الأيضي الميتوكوندريا مثل إمكانات الغشاء ودخول الركيزة. لإجراء التحليل الطيفي البصري لانتقال جدار القلب، يتم وضع قسطرة الألياف البصرية المتاحة تجارياً في البطين الأيسر للقلب المعزول المندمج كمصدر للضوء. يتم جمع الضوء الذي يمر عبر جدار القلب مع الألياف البصرية الخارجية لإجراء مطياف بصري للقلب في الوقت الحقيقي القريب. ويتجنب نهج الإرسال العديد من التداخلات المنعثرة على السطح التي تحدث في نُهُج الانعكاس المستخدمة على نطاق واسع. وقد تم قطع التغيرات في أطياف الامتصاص عبر الجدارية باستخدام مكتبة من الأطياف المرجعية للكرومووفور، مما يوفر مقاييس كمية لجميع الكرومومور القلبية المعروفة في وقت واحد. وقد قضى هذا النهج الطيفي على الأخطاء الجوهرية التي قد تنجم عن استخدام أساليب الطول الموجي المزدوج الشائعة المطبقة على أطياف الامتصاص المتداخلة، كما قدم تقييماً كمياً لصلاح الملاءمة. تم تصميم برنامج مخصص للحصول على البيانات وتحليلها، مما سمح للمحقق برصد الحالة الأيضية للإعداد خلال التجربة. هذه الإضافات البسيطة نسبيا إلى نظام ضخ القلب القياسية توفر نظرة فريدة من نوعها في الحالة الأيضية لجدار القلب بالإضافة إلى المقاييس التقليدية للانكماش، والتسريب، واستخراج الركيزة / الأكسجين.

Introduction

مطياف الامتصاص البصري لرصد الكيمياء الحيوية للجهاز سليمة هو نهج يستخدم علىنطاق واسع بسبب طبيعته الجوهرية، غير المدمرة 1،2،3،4،5، 6،7،8،9. امتصاص الميوغلوبين يوفر مقياسا لمتوسط التوتر الأكسجين السيتوسيلي10،11،12. الميتوكوندريا الميتوكوندريا توفر معلومات بشأن دخول الركيزة على مستوى الفلافين،وإمكانات الغشاء من السيتوكروم ب L:bH13،وتسليم الأكسجين إلى الميتوكوندريا في الخلية من أوكسيديز السيتوكروم (كوكس ) حالة الأكسدة14. وقد أثبت Glancy وآخرون أن أنشطة كل مركبة يمكن تحديدها عن طريق قياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومعدل التمثيل الغذائي15. وبالتالي، باستخدام التحليل الطيفي البصري، يمكن الحصول على ثروة من المعلومات دون الحاجة إلى تحقيقات خارجية أو تعديلات رئيسية في نظم الدراسة الحالية. الهدف من هذه الورقة هو تقديم طريقة قوية لجمع الأطياف البصرية الإرسال في الاستعدادات التقليدية للقلب الممزوج مع التعديل الرئيسي الوحيد الذي يجري إجراء الدراسات في بيئة مظلمة.

وقد تم استخدام مطياف امتصاص انعكاس بنجاح لإجراء مطيافبصري للقلب الممزوج 3،6،16،17،18،19 كذلك كما القلب في الجسم الحي1. يتكون التحليل الطيفي العاكس من المساس بالضوء على سطح القلب وجمع الضوء المتناثر في القلب وكذلك الضوء المنعكس المنتشر والطيفي. وهكذا، فإن الضوء الذي تم جمعه في هذا النهج هو مركب من آليات التشتت المتعددة، فضلا عن امتصاص الكروموروف الأنسجة من الفائدة. بسبب الحركة والسطح المعقد للقلب، انعكاس الضوء قبالة سطح القلب هو إشكالية خاصة، وتغيير عمق الاختراق وكمية من الضوء المنعكس بحتة.

تم حل قيود مطياف امتصاص الانعكاس المذكورة أعلاه عن طريق إدخال قسطرة بصرية في تجويف البطين الأيسر، مما يسمح بجمع الضوء المنقول عبر الجدار الأيسر الخالي من البطين20. وقد تم تقدير فوائد مطياف الإرسال لهذا النوع من الدراسات في الدراسات الغازية المبكرة من قبل تامورا وآخرون9 يوفر التنفيذ الحالي تحليلا ً مطيافياً قوياً جداً لامتصاص الإرسال للقلب السليم مع فيما يتعلق بالأكسجين الدوري ودولة الميتوكوندريا الأكسدة تحت مجموعة متنوعة من الظروف21. استخدمت هذه الدراسات الأولية قسطرة ملفقة خصيصا مع الصمام بالطاقة على طرف المنحى لتوليد نمط اطلاق الجانب من الضوء الأبيض من خلال عضلة القلب. ومع ذلك، فإن القسطرة الكبيرة نسبيا ً ذات الرؤوس الليدية مناسبة فقط للاستخدام في القلوب متوسطة الحجم (أرنب، خنزير غينيا، إلخ) والتصنيع المخصص المطلوب. في الدراسة الحالية، يتم تقديم طريقة لاستخدام الألياف البصرية 200 ميكرون الأساسية المتاحة تجاريا كدليل الضوء. بدلاً من LED السلكية في الطرف، القسطرة مع طرف 500 ميكرو يعيد توجيه الضوء من مصدر خارجي زيادة براعة النظام. يسمح هذا النهج باستخدام مجموعة واسعة من مصادر الضوء الخارجية بما في ذلك الليزر لتطبيقات مثل التحليل الطيفي لتشتت رامان. ولتحديد هذه البيانات كمياً، يُقدَّم تحليل طيفي كامل متعدد المكونات على الإنترنت باستخدام أطياف مرجعية معروفة لتحسين دقة التحديد الطيفي للكروموفوريات القلبية على النحو الموصوف سابقاً20و22. وسيقدم المؤلفون رمز المصدر لهذا التحليل عند الطلب. باستخدام هذا النهج ، يمكن الحصول على معلومات عن الكيمياء الحيوية القلبية ووظيفة الميتوكوندريا في وقت واحد مع المعلمات الوظيفية القلبية التقليدية مع تأثير ضئيل أو معدوم على إعداد القلب. وبما أن القلب يعتمد بشكل حاسم على وظيفة الميتوكوندريا وتوصيل الأكسجين، فإن هذه الإضافة التقنية إلى نظام القلب الكلاسيكي المنصهر سوف تحسن إلى حد كبير تفسير وفائدة هذا النموذج الهام من أداء القلب.

Protocol

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوانية من قبل اللجنة الوطنية لرعاية الحيوانات واستخدامها في معهد القلب والرئة والدم، وتم تنفيذها وفقاً للمبادئ التوجيهية الموضحة في قانون رعاية الحيوانات ورفاهها (7 USC 2142§ 13). 1. معزولة Perfused نظام القلب وPerfusate ملاحظة: هذا الإعداد مشابه جداً للمنشورات السابقة23. جعل 4 لتر اتّبع من [كريبس-هنّيليت] يعدّل [برفوست] يتألّف (في [ممول/ل])137.0 [كلك], 5.4 [كلك], 1.8 [كلك] 2, 0.5 [مغكل]2,1.0 [ن]2[هبو]4,10.0 جلوكوز, 1.0 لاكتات, و10.0 [هبس]. درجة الحموضة perfusate إلى 7.4 في 37 درجة مئوية مع هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك. قم بتصفية البيرفوسات من خلال غشاء مسام 1 ميكرومتر. شطف جميع الأنابيب وغرف من نظام القلب perfused عن طريق تشغيل واستنزاف المياه النقية من خلال النظام. نقل perfusate في الخزان والأكسجين مع 100٪ س2 مع bubbler مع الحفاظ على درجة الحرارة في 37 درجة مئوية باستخدام حمام الماء المتداول ساخنة. إضافة 2 من 12 ميكرومتر مرشحات غشاء المسام ورئيس النظام مع perfusate أثناء إعادة تدوير في وضع Langendorff. إرفاق المشبك أنابيب على أنبوب الحق فوق قنية الأبهر وضبط المسمار بحيث ينخفض تدفق الأبهر إلى حوالي 10 مل / دقيقة. 2. استئصال قلب الأرنب والتسريب استئصال القلب التخدير الذكور الأرانب البيضاء نيوزيلندا (حوالي 3 كجم) عن طريق حقن عضلي 1.5 مل من خليط الكيتامين / acepromazine (10:1). بعد حوالي 10-15 دقيقة، قم بإدارة 3٪ من الإيسوفيلوران عن طريق الاستنشاق للحصول على تأثير مخدر كامل. تأكيد العمق السليم للتخدير عن طريق قرصة اصبع القدم ومن ثم وضع خط في الوريد الأذن الهامشية لإدارة الأدوية اللاحقة. حقن 1500 وحدة (أو 1.5 مل من 1000 وحدة / مل) من الهيبارين والسماح تعميم لمدة 3 دقائق. فحص مزدوج للعمق السليم للتخدير ومن ثم القتل الرحيم مع 6 مل (أو 3 مل من 2 مل/ مل) من KCl. فتح بسرعة الصدر، وتحديد قمة القلب والأبهر. إزالة القلب عن طريق قطع الشريان الأبهر بعيدا عن القلب قدر الإمكان وقطع الأوردة الرئوية أقرب ما يمكن إلى الرئتين.ملاحظة: إزالة الرئتين في هذه المرحلة المبكرة يختلف عن المنشور السابق23 ولكن ليس له تأثير على التحضير. ضع القلب في كوب صغير من البيرفوسات (نفس البيرفوسات كخطوة 1.3) جالساً في دلو من الثلج للنقل من الجراحة إلى التسريب. تعليب القلب Cannulate وربط الأبهر بشكل آمن، والتأكد من عدم إدراج أي فقاعات في خط الأبهر. بدء تدفق في 70 ممزئبق ضغط التسريب عن طريق إزالة المشبك الأنابيب على خط الأبهر والحفاظ على هذا الضغط خلال ما تبقى من الجراحة وتعليب السفينة. فصل الشريان الرئوي من الشريان الأبهري والأوعية الأخرى وligate الوريد الوريد والأوردة الرئوية. إزالة الدهون والأنسجة الضامة لا تزال موجودة. كانوليت الشريان الرئوي لتوفير مقياس لمعدل تدفق الجيوب الأنفية التاجية وتوتر الأكسجين. تخلص من التدفق الأولي من القلب (لمدة 10 دقائق) أثناء التحضير للقضاء على الدم والحطام الجراحي. بعد هذه الفترة، إعادة تعميم perfusate. 3. الجانب اطلاق الألياف البصرية التنسيب قم بتوصيل قسطرة الألياف البصرية بمصدر ضوء أبيض LED عالي الطاقة إلى جانب الألياف للمساعدة في التصور وكذلك توفير الضوء للتنظير الطيفي مرة واحدة في القلب. قطع ملحق صغير من الأذين الأيسر، أدخل القسطرة في البطين الأيسر عبر الصمام التاجي، ثم تدويره لتحقيق جدار البطين الأيسر المضيء الحرة. ضع الألياف البصرية الصغيرة مباشرة قبالة المنطقة من الإضاءة القصوى للبطين الأيسر في حوالي 1 سم من القلب. قم بتوصيل الطرف الآخر من ألياف البيك آب بمطياف المسح السريع. 4. التحليل الطيفي البصري أطفئ الأضواء في المنطقة التجريبية للحصول على ظلام دامس بدء تشغيل البرنامج المخصص، ودمج برامج تشغيل مطياف لإجراء الحصول على البيانات وتحليل في الوقت الحقيقي للضوء المرسل.ملاحظة: يتم توفير نسخة قابلة للتنفيذ من الإصدار الموحد من برنامج اكتساب وتحليل الطيفية كملف ترميز تكميلي. تتوفر شفرة المصدر عند الطلب إلى المؤلفين. انتقل من خلال جميع المطالبات، واختيار خيارات لوضع الحصول على مطياف القلب perfused. في الصفحة التالية، قم بالإشارة إلى ما إذا كان يتم جمع البيانات الإضافية. وأخيراً، أدخل معلمات الاقتناء، بما في ذلك موقع كل من الأطياف المرجعية للكروموفورية والبيانات التي يتعين حفظها. أدخل عرض نطاق ترددي من 490-630 نانومتر. أدخل معدل أخذ عينات قدره 2 هرتز (أي عينتين في الثانية). جمع تيار داكن، أو صفر ضوء، الطيف لتصحيح مستويات إشارة الخلفية عن طريق إيقاف مصدر الضوء. انقر لتحديد المراجع الكروموسومية المطلوب لاستخدامها في روتين المناسب. في صفحة الحصول على البيانات، اضبط موضع كل من القسطرة وألياف البيك آب لتحقيق أقصى قدر من الضوء المرسل المعروض على البرنامج مع إيلاء اهتمام خاص لسعة الإشارة في منطقة 500 نانومتر، حيث myoglobin المؤكّث وينبغي ملاحظة الامتصاصات. تأكد من أن الضوء المرسل لا يشبع الكاشف في منطقة 600 نانومتر. تأكد من عدم مساهمة أي مصادر ضوء خارجية في الطيف الذي تم جمعه عن طريق إيقاف تشغيل إضاءة القسطرة والتأكد من عدم اكتشاف أي ضوء الآن. بدء جمع البيانات بالنقر فوق الزر حفظ الأطياف. انقر على مجموعة كتحكم لعرض طيف امتصاص الفرق من الأطياف المستقبلية إلى طيف “التحكم” الحالي. إجراء أي اضطراب فسيولوجي على النحو المطلوب. البروتوكول 1: تأثير السيانيد على أداء القلب وامتصاص الكروموفوري توقف عن إعادة تدوير السوائل من ضخ القلب. باستخدام مضخة حقنة، حقن السيانيد (2.5 إلى 75 ملي في الرقم الهيدروجيني 7) بمعدلات مختلفة إلى perfusate قبل قنية الأبهر مباشرة لتحقيق التركيزات المطلوبة من السيانيد (0.025 إلى 1 MM، محسوبة من معدل تدفق الأبهر) في perfusate المتدفقة في القلب في حين مراقبة وظيفة القلب والخصائص البصرية. وقف مضخة حقنة السيانيد عندما تكون الآثار على تدفق التاجي ومعدل ضربات القلب جنبا إلى جنب مع انتقال البصرية من خلال جدار القلب في حالة ثابتة. البروتوكول 2: نقص التروية/نقص الأكسجة توقف عن ضخ السيانيد بعد 5 دقائق تبديل الغاز محتدما من الأكسجين 100٪ إلى النيتروجين 100٪ لإزالة الأكسجين من النظام. بعد حوالي 10 دقائق، وقف التدفق لمحاكاة حالة نقص تروية / نقص الأكسجة الكلي. 5- تحليل البيانات الطيفية قم بتشغيل البرنامج في وضع تحليل القلب المنصهر. حدد مطياف مناسب. أدخل مسار ملف البيانات وملف الأطياف المرجعيوحدد مصدر ضوء القسطرة، الذي يقوم بتحميل الطيف المحفوظ مسبقًا لمصدر ضوء القسطرة. حدد قراءة بيانات سلة المهملات. حدد تعيين الحد الأدنى وأقصى الطول الموجي. أدخل عرض النطاق الترددي لتحليل البيانات ك490-630 نانومتر. حدد العودة إلى القائمة الرئيسية. حدد قراءة المراجع. تأكيد الأطياف المرجعية لاستخدامها في التحليل. حدد العودة إلى القائمة الرئيسية. حدد نقاط الوقت في القائمة الرئيسية. حدد نقطة زمنية T0 كعنصر تحكم وقم بتعيين النطاق إلى 100 نقطة. حدد نقطة زمنية T1 كفترة تجريبية في نطاق 100 نقطة. لاحظ طيف الفرق الخام في علامة التبويب طيف Abs. متوسط. حدد حساب معاملات الملاءمة ثم انقر فوق علامة التبويب معاملات الملاءمة لمراقبة مسار الوقت لاحتواء الأطياف المرجعية. العودة إلى القائمة الرئيسية وحدد حساب الفرق عبس. حدد T0 و ΔT1 في جميع المراكز. لاحظ الطيف المجهز في نافذة طيف الفرق وعناصر التركيب في نافذة الوزن المرجعي. كرر هذا الإجراء لمقارنة نقاط الوقت الأخرى في التجربة. العودة إلى القائمة الرئيسية. حفظ البيانات والتحليل في تقرير جدول بيانات عن طريق الكتابة في الاسم المطلوب وتحديد حفظ البيانات لمزيد من التحليل مع البرامج الأخرى.ملاحظة: إذا لم يتم كتابة أي اسم يتم حفظ التقرير بنفس اسم ملف الإدخال. يتم حفظ التقرير في مجلد يسمى ملفات تحليل Excel، الموجود في نفس المجلد مثل ملف الإدخال الأصلي.

Representative Results

النظام المستخدم هو خارج الجرف الحيوان الصغير نظام القلب التسريب ولكن تم تعديلها بشكل كبير للاستخدام مع قلب أرنب. وكانت التعديلات في المقام الأول لزيادة حجم تتحمل من جميع الأنابيب لضمان تدفق كافية التسليم إلى قلب الأرنب. وقد تم توخي الحذر الشديد لضمان، في ضغوط التسريب المستخدمة، تجاوز معدل تدفق نظام التسريب الأصلي التدفق مع القلب تعلق من قبل ما لا يقل عن 5 أضعاف. تم وضع مرشحات غشاء المسام 2-12 م بالتوازي بين مضخة السوائل وغرفة فخ فقاعة التحميل المسبق الأبهرية لإزالة أي حطام من القلب. ضوء منقول من قلب الأرنبويعرض الشكل 1 طيف القسطرة (الشكل1ألف) والطيف الخام للضوء المنقول من جدار قلب الأرنب الحر (الشكل1باء). هذه البيانات تكشف عن التوهين كبيرة جدا من الضوء في المنطقة الزرقاء من الطيف، ولكن يمكن ملاحظة نطاقات الامتصاص من الميوغلوبين والسيتوكرومات الميتوكوندريا مباشرة بين 490 و 580 نانومتر في إدراج. من المهم في هذه الدراسات لضمان الكشف عن ما يكفي من الضوء المنقول في المنطقة من 490 إلى 630 نانومتر للحصول على معلومات عن الكروموفوريات القلبية المستجيبة أيضيا. يتم تعديل تحديد المواقع من الألياف الخارجية والداخلية قبل حفظ البيانات لتحقيق أقصى قدر من كثافة الضوء ولكن لا تشبع كاشف في منطقة 625 نانومتر. مرجع يقلّل ناقص مؤكسدة أطياف من مرجع [كروموهورس] في القلب.ويعرض الشكل 2 الأطياف المرجعية المستخدمة لتلائم الأطياف المثلالتي جمعت في هذه الدراسات. وتشمل هذه المراجع الميوغلوبين, السيتوكروم AA3 (بدلا من ذلك السيتوكروم605 وcytochromea 607, اعتمادا على نوع من الاضطراب22), السيتوكرومa 580, السيتوكروم بL, السيتوكروم بH ، السيتوكروم ج، السيتوكروم ج1،FAD، تمثيل امتصاص ضوء الحادث (يشير أنا0، والذي يستخدم لحساب الضوء المنخل، وهذا هو، الفوتونات التي ذهبت من خلال الأنسجة دون أن يتم استيعابها)، وخط (مع متفاوتة الميل والاعتراض لحساب التشتت، غير مبين في الشكل2). بعض الأطياف صاخبة، كما كان تركيز المواد المرجعية النقية منخفضة جدا22. مسار زمني من الأطياف المرجعية يناسب خلال التجربة الإجماليةيمثل الشكل 3 مسار الوقت لتجربة نموذجية محسوبة في الخطوة 5.15 من البروتوكول. هذا يتكون من مرحلة التحكم، تليها مرحلة حقن السيانيد، تليها غسل السيانيد، تليها مرحلة إزالة الأكسجين، وأخيرا نقص التروية. يتم رسم التغييرات في الكروموفوريس الفردية (الميوغلوبين، السيتوكروم AA3، وc السيتوكروم) مع مرور الوقت جنبا إلى جنب مع معدل التدفق التاجي. ويقدر التغير البصري في الكثافة لكل كروموفور بضرب معامل الملاءمة الذي تم الحصول عليه من روتين المربعات الخطيالأقل والذروة التمثيلية للكرومووفور (أو الامتصاص الأقصى للكرومووفور المذكور). على سبيل المثال، بالنسبة للميوغلوبين، يتم ضرب معامل الملاءمة للإشارة الميوغلوبين بقيمة الطيف المرجعي الميوغلوبين عند 580 نانومتر. لاحظ الأكسجين السريع من الميوغلوبين إلى إضافة السيانيد يقابله زيادة في التدفق ولكن قبل انخفاض كبير من السيتوكرومات. يتم استرداد هذا التأثير جزئيا مع غسل السيانيد. وأخيرا، يتم الحصول على الحد الكامل من السيتوكرومات وإزالة الأكسجين من الميوغلوبين مع نقص التروية. وتبين هذه البيانات أن البيانات الدينامية المتعلقة بالحالة الأيضية للقلب يمكن الحصول عليها بسهولة مع هذه المنهجية. يتم وضع موضع الأطياف المستخدمة للفرق الأطياف في هذا الوقت بالطبع كما يلي: خط الأساس C، حقن سيانيد CN، CNW سيانيد غسل، H N2 نقص الأكسجة (النيتروجين يجري فقاعات في perfusate بدلا من الأكسجين)، وHI لا نقص التروية تدفق (لا perfusate تتدفق من خلال القلب). اختلاف الطيف من العلاج السيانيد مقابل السيطرة وتناسب الطيف الفرق السيانيد من قلب الأرنب.للحصول على طيف الفرق، يتم طرح اثنين من الأطياف المطلقة. يتم الحصول على كل طيف مطلق عن طريق أخذ متوسط من العديد (عادة 100) الأطياف لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء. الشكل 4 A يمثل الطيف الفرق من التحكم (C) والسيانيد (CN) القلب المعالج. باستخدام الأطياف المرجعية الموضحة في الشكل2، يتم حساب الطيف المناسب. الطيف المتبقي هو طرح صالح من البيانات الخام. ويُستخدم نفس المخطط في جميع العروض الطيفية اللاحقة. الشكل 4 يعرض B سعة الأطياف من الأطياف المرجعية (الموضحة في الشكل2) المستخدمة لتناسب الشكل 4ألف. ويلاحظ زيادات قوية في امتصاص معظم السيتوكرومات كما تم حظر تدفق الإلكترونات أسفل سلسلة السيتوكروم بواسطة السيانيد في حالة ثابتة. وبالإضافة إلى ذلك، زاد امتصاص الميوغلوبين المؤكّس مع القضاء على استهلاك الأكسجين بواسطة السيانيد. الشكل 4 C يعرض الأطياف الفرق وتناسب الطيف الفرق من CNW وCN، وكشف عن انعكاس جزئي لتأثير السيانيد. وقد تحقق ذلك عن طريق اختيار نقاط زمنية في الخطوة 5-18 من البروتوكول، ونقل T0 إلى CNW وT1 إلى منطقة CN من الدورة الزمنية. الشكل 4 D يعرض الطيف الفرق من HI و C، الذي يمثل حالة منزوعالأكسجين تماما وانخفاض من السيتوسول والميتوكوندريا مقابل حالة التحكم. مرة أخرى، تم تنفيذ هذا في الخطوة البروتوكول 5.18، نقل T0 إلى C و T1 إلى HI. دورة زمنية أولية من آثار السيانيد على تدفق التاجية والكروموفوريسالشكل 5 يظهر مثال على بدء تأثير السيانيد على الأنسجة. يناسب الميوغلوبين، يتم تقديم السيتوكروم605 وc السيتوكروم جنبا إلى جنب مع تدفق التاجية لقلب واحد. تم إنشاء هذه الدورات الزمنية في الخطوة البروتوكولية 5.15 لتجربة السيانيد. ويرد الفرق الفردي مقابل خط الأساس (الموقف 1) في الشكل 5باء. تم إنشاء الأطياف من رقم الموضع المقابل (1-4) في الدورة الزمنية. وقد تم تحقيق ذلك في الخطوة البروتوكولية 5-18، حيث كان T0 دائماً في الموقع 1، وبعد ذلك تم إنشاء أطياف مختلفة (2-4) عن طريق نقل T1 إلى الوضع 2 و3 و4 على التوالي. وكان من المستغرب إلى حد ما ملاحظة أن تدفق والأكسجين الميوغلوبين زيادة قبل تغييرات كبيرة في حالة الأكسدة السيتوكرومية. وقد قُدِّر بدء التغيرات في التدفق وامتصاص الكروموروف باستقراء خطي لمعدل التغير الأولي من خط الأساس. باستخدام هذا النهج، ووضع التغيير في تدفق التاجية كما صفر الوقت، بدأت الزيادة في الأوكسجين الميوغلوبين 1.71 دقيقة ± 0.39 دقيقة بعد التغيير في التدفق، في حين أن السيتوكروم a605 وامتصاص c السيتوكروم كانت متطابقة تقريبا ولكن أبطأ بكثير في 4.24 دقيقة ± ± 0.76 دقيقة و 4.34 دقيقة ± 0.77 دقيقة، على التوالي (ن = 8). وتشير هذه البيانات إلى أن السيانيد يرتاح لهجة الأوعية الدموية24 قبل حدوث تغيير كبير في حالة التمثيل الغذائي للعضلة القلبية. يحدث هذا التأثير على الأرجح بسبب السيانيد الذي يواجه العضلات الملساء الوعائية قبل الوصول إلى جرعة فعالة حول خلايا القلب. تقديرات الأوكسجين الميوغلوبين في قلوب التحكمباستخدام بيانات السيانيد كتقدير لإجمالي أكسجين الميوغلوبين وبيانات نقص التروية للميوغلوبين منزوع الأكسجين بالكامل، نقدر أنه في ظل ظروف التحكم كان الميوغلوبين 88.2٪ فقط ± 1.0٪ (ن = 10) أكسجين، بما يتفق مع الدراسات السابقة20 , 21 , 25. الشكل 1 أطياف القسطرة البصرية الجانبية. (أ) هذا هو طيف من الضوء المنبعث من مصدر الضوء البعيد من خلال القسطرة التي تم الكشف عنها مع الألياف بيك اب في حوالي 1 سم من القسطرة. في هذه الهندسة، والقلب غائب ة وكثافة مصدر الضوء يتم ضبطها بحيث لا يشبع الكاشف. (ب) يتم إدخال قسطرة الإشعال الجانبي في البطين الأيسر ويتم جمع الضوء المنقول من القلب وعرضه. يُظهر الإدراج توسيع المنطقة من 400 إلى 580 نانومتر، مما يكشف عن انتقال معقد للضوء من هذه المنطقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2 الأطياف المرجعية للكروموبوسالات القلبية المستخدمة للتركيب الطيفي: تم جمع الأطياف عن طريق مجموعة متنوعة من الطرق22 وهي من انخفاض – أكسدة (للسيتوكرومات) ومنزوع الأكسجين – أكسجين (لmyoglobin). بالنسبة لـ I0، يتم تحويل الطيف في الشكل 1A ببساطة إلى مصطلح امتصاص لجعل المرجع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3 التدفق والتغيرات البصرية مع مرور الوقت. تغيير الكثافة البصرية (ΔOD) من كل كرومووفور هو ببساطة الطيف الكرومووفور الفردية المجهزة في امتصاصه الأقصى. وكانت ترددات الامتصاص القصوى كما سبق وصفها20،26. الدورة الزمنية المقدمة هي لتجربة واحدة، تظهر خط الأساس، تليها حقن السيانيد (0.10 mM في أقصى تدفق perfusate)، غسل السيانيد، نقص الأكسجة النيتروجين التي أجريت عن طريق استبدال الأكسجين مع النيتروجين، ومن ثم نقص التروية كاملة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4 تركيب الأطياف الفرق من مختلف الظروف. (ألف) طيف حقن السيانيد مطروحاً منه خط الأساس. كما يتم رسم الطيف المناسب الذي تم الحصول عليه من أقل روتين مربع. الطيف المتبقي هو الفرق بين الأطياف الخام وتناسب. (ب) الأطياف المرجعية المستخدمة لإنشاء الملاءمة المعروضة في الشكل 4ألف. ويقيس البرنامج المراجع الواردة في الشكل 2 لمساهمتها النسبية في طيف الفرق الحالي. (ج) كما هو الحال في A، ولكن تبين طيف الفرق من غسل مقابل حقن السيانيد. (د) نفس ما هو عليه في A، ولكن تبين طيف الفرق من نقص التروية مقابل خط الأساس. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5 عالية الدقة الزمنية من تأثير ضخ السيانيد على السيتوكرومات المختارة، الميوغلوبين وتدفق القلب. (أ) مسار الوقت من تدفق القلب، ديوكسيميوغلوبين، خفض السيتوكروم605،وانخفاض السيتوكروم ج. تشير الأرقام إلى موقف الأطياف المتخذة بالنسبة إلى خط الأساس في الشكل 5باء. (ب) الأطياف الفارقة للوظائف الأربعة المسماة في الشكل 5ألف مقابل التحكم (الموقف 1). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يعد إعداد القلب الرجعي أو العامل المعزول الدعامة الأساسية في دراسة فسيولوجيا القلب وكذلك التحقيق قبل السريري للتقنيات والأدوية في القلب. وكان مفتاح استخدامه سهولة التحضير، والخصائص الوظيفية القوية والسيطرة على المعلمات التجريبية، فضلا عن القدرة على قياس العديد من المعلمات الوظيفية للقلب النابض. يوفر التحليل الطيفي للامتصاص البصري نظرة ثاقبة على أكسجين الأنسجة وكذلك الأنشطة الأيضية الميتوكوندريا. وقد أجريت مطياف بصري في المقام الأول في دراسات القلب المندمجة المعزولة في وضع انعكاس أن من الصعب تفسير بسبب الحركة ومضاعفات تشتت الضوء.

لقد أدخلنا مطياف بصري لنقل جدار البطين (VWTOS) لتوفير طريقة قوية لمراقبة الكروموفوريات الأيضية للأنسجة القلبية. في منشور سابق، أظهرنا أن LED hardwired إلى غيض من كابل محوري20 يجعل مصدر ضوء فريد داخل القلب الجانب اطلاق التي يمكن استخدامها لVWTOS القلوب الممزوجة. يشير إطلاق النار الجانبي إلى إسقاط الضوء المتعامد إلى المحور الطويل للقسطرة، وهو مثالي لإضاءة الجدار الخالي من البطين. كانت قسطرة LED صغيرة بما يكفي لعدم تأثير وظيفة القلب ولكنها تتطلب تصنيع متخصص في المختبر. تعرض الدراسة الحالية استخدام 500 ميكرون القسطرة الجانبية التجارية التي يمكن أن تقترن بأي مصدر ضوء متوافق مع الألياف البصرية. تم تطوير هذه القسطرة البصرية الجانبية تطلق تجاريا للاستئصال بالليزر عمودي على المحور الطويل للألياف. وبطبيعة الحال، ونحن نستخدم الطاقة الخفيفة أقل بكثير مما هو مطلوب للاستئصال الضوئي. ألياف أصغر متاحة للاستخدام على الاستعدادات الصغيرة مثل قلب الماوس perfused27. وقد وفر نظام الألياف البصرية هذا إضاءة كافية من خلال جدار القلب في نطاق الطول الموجي حيث تمتص الكرومات القلبية (450-630 نانومتر). باستخدام الألياف البصرية بيك آب على الجزء الخارجي من القلب، يمكن رصد امتصاص الميوغلوبين والميتوكوندريا الميتوكوندريا مع دقة زمنية وطيفية ممتازة (انظر الشكل5). نهج الألياف البصرية الجانب اطلاق لديه العديد من المزايا على القسطرة LED لVWTOS، بما في ذلك أصغر بكثير عبر مقطع ية من القسطرة التي تقلل من تأثير القسطرة على القلب، والحد من تأثير أكثر مرونة على صمام القلب و أداء البطين، لا اتصالات الكهربائية التي يمكن أن تنقص في perfusate المالحة، وأخيرا القسطرة التي تستخدم مصدر الضوء الخارجي الذي يزيد من مرونة اختيار مصدر الضوء لVWTOS.

بسبب امتصاص قوي للقلب تحت 490 نانومتر, من الصعب توليد الكثير من المعلومات على الفرقة Soret من السيتوكرومات في منطقة 410-445 نانومتر أو NADH في 340 نانومتر. وهكذا، فإن الامتصاص الواسع للالباهت في 450 نانومتر هو أقل امتصاص للتردد الذي لوحظ، على الرغم من أن ذروة امتصاص هذا الكروموفوريس بأكملها لا يتم أخذ عينات منها. باستخدام VWTOS نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية جداً كما يتم أخذ عينات من الجدار بأكمله على النقيض من مطياف انعكاس السطح، وتستخدم عادة20، والتي عينات فقط من سطح القلب مع العديد من القضايا التشتت. VWTOS أخذ العينات جدار القلب بأكمله هو أكثر مماثلة لتدابير التحليل الطيفي الرنين المغناطيسي النووي (NMRS) من العديد من الأيض القلب مثل 31P الكشف عن أدينوسين ثلاثي الفوسفات وفوسفات الكرياتين28، 13C الكشف عن المسمى الأيض29،30 بما في ذلك التسميات hyperpolarized31،32، و 1H الكشف عن الأيض33. وبما أنه يمكن إجراء نظام فولكس فاجنوس باستخدام أجهزة غير مغناطيسية، فمن الممكن تماماً أن يتم إجراء NMR وVWTOS في وقت واحد. VWTOS لا يقتصر على الكروموفوس الذاتية ويمكن استخدامها لرصد الامتصاص من تحقيقات بصرية لـ الرقم الهيدروجيني، كاليفورنيا2+، وإمكانات غشاء البلازما.

نحن نستخدم 2 هرتز (أي 2 عينات / ثانية) الذي يوفر إشارة طيف واحد ممتاز للضوضاء. على الرغم من أن معدلات أخذ العينات أعلى يمكن تحقيقها التي تسمح بتحليل دورة القلب، وقد أظهرت الدراسات السابقة أنه لا يوجد فوز للتغلب على الاختلاف في امتصاص الكروموروف، لذلك لم يكن هناك جهد لجمع الضوء بشكل انتقائي كدالة لدورة القلب كان أدلى34. بسبب هندسة VWTOS، الكشف عن الضوء هو أقل اعتمادا على حركة الأنسجة من أساليب التفكير، منذ يتم القضاء على الأحداث المعقدة تشتت السطح. نجد أن الحركة الشديدة يمكن أن تعطل هذه التدابير، ولكن التحليل الطيفي في الوقت الحقيقي يكشف بسرعة عن التحولات الطيفية غير المتسقة مع انتقالات كرومووفور الأنسجة. مرة أخرى، وهذا يحدث فقط عندما يتحرك القلب بشكل صارخ بعيدا عن جمع الألياف مما يقلل بشكل كبير من كمية الضوء المنقولة التي تم جمعها.

يتم تحليل بيانات VWTOS باستخدام روتين التركيب الطيفي الكامل استناداً إلى مكتبة مرجعية من أطياف الكروموفورية القلبية وطيف مصدر الضوء كما سبق وصفه20،22،27، 35 مع نهج المربعات الخطية البسيطة الأقل. ويعوض هذا الإجراء الطيفي عن تداخل طيف الامتصاص ولا يعتمد على الأطوال الموجية “الإبوية”. هذا التحليل الطيف الكامل يلغي القطع الأثرية المرتبطة شعاع مزدوج مشترك(أي اثنين من الطول الموجي) تحليل 1،3،6 التي ثبت أن إشكالية20. والميزة المضافة للتحليل الطيفي الكامل هي توليد الخير المناسب من المخلفات، غير المتاحة في بروتوكولات الحزمة المزدوجة.

في هذه الدراسة، ركزنا على تأثير السيانيد على الخصائص البصرية للقلب. كما كتل السيانيد أوكسيديز السيتوكروم، فإنه يمنع استهلاك الأكسجين والنتائج أساسا في انخفاض صافي من جميع السيتوكرومات كما الإلكترونات احتياطيا في سلسلة السيتوكروم. ومع ذلك، فإن إمكانات الغشاء على ما يبدو لا تزال عالية، كما يتغير الأكسدة في BL و BH صغيرة جدا بالمقارنة مع السيتوكروم ج13. مع وقف استهلاك الأكسجين، يجب أن يقترب توتر الأكسجين في الأنسجة من البيرفوسات ولاحظنا زيادة مبكرة في الميوغلوبين المؤكّس مع السيانيد بما يتفق مع فكرة أن القلب المملح الممزوج، حتى في التسريب الرجعي وسائط، لا أكسجين تماما myoglobin في سيتوسول19،20،21،36. مقارنة التأثير الأقصى للسيانيد على الميوغلوبين المؤكّس مع الطيف منزوع الأكسجين بالكامل الذي تم الحصول عليه مع نقص التروية يكشف عن أكسجين الميوغلوبين بحوالي 88% فقط، بما يتفق مع الدراسات السابقة.

من المهم أن نلاحظ في هذه الدراسة أن آثار السيانيد على الأوكسجين الميوغلوبين والحد من السيتوكروم تم حلها زمنيا. ومن المستغرب أن آثار السيانيد لوحظت لأول مرة على تدفق التاجي وmyoglobin قبل أن لوحظت تغييرات كبيرة في حالة السيتوكرومات الأكسدة. الزيادة الملحوظة في وقت مبكر في التدفق تشير إلى أن تأثير على العضلات الملساء الشريانية24,37 قد تحدث قبل أن لوحظت الآثار الأيضية الإجمالية في خلايا القلب. الزيادة في التدفق، وربما مع انخفاض متواضع يسببها السيانيد في التنفس، من المرجح أن يؤدي إلى زيادة فورية في الغلوبين المؤكّس الناجم عن الزيادة في تسليم الأكسجين. مع انتشار تثبيط السيانيد إلى الخلايا العضلية ، لوحظ حدوث زيادة أخرى في تدفق الشريان التاجي (انظر المنطقة ملحوظ 3 في الشكل 5أ)،على الأرجح مدفوعة بالعديد من العوامل الأيضية38. التأثير المبكر الكبير للسيانيد على التدفق يشير إلى أن عملية التمثيل الغذائي للعضلة الملساء الوعائية قد تكون أكثر فعالية في تغيير لهجة الأوعية الدموية من عملية التمثيل الغذائي للخلايا العضلية. هذه البيانات تدعم فكرة راسخة أن الميوغلوبين لديه تقارب أقل بكثير للأكسجين من كوكس، حتى في القلب السليم، كما حدث الأوكسجين الميوغلوبين قبل فترة جيدة من التغيرات في حالة الميتوكوندريا ريدوكس (الشكل 5). هذا المستوى العالي من الميوغلوبين منزوع الأكسجين في ظل ظروف التحكم يتسق مع الدراسات السابقة التي تشير إلى أن القلب المملح المعزول قد يكون نقص الأكسجة جزئيا حتى في ظل ظروف التحكم9،19، 20،21،27،36،يؤكد على أهمية مراقبة أكسجين أنسجة القلب عند استخدام هذا النموذج الهام في فسيولوجيا القلب.

نقدم هنا التفاصيل التجريبية لإجراء مطياف امتصاص الإرسال على القلب المعزول. لقد قمنا بنجاح تكييف هذه التقنية لاستخدامها على القلوب من الأرنب إلى الماوس باستخدام رقيقة الجانب اطلاق الألياف البصرية داخل القلب. باستخدام أحدث الإجراءات التركيب الطيفي الكامل، يمكن استخراج التفاعل البصري المعقد للكروموفوريات القلبية بسهولة توفير، وهو مقياس في الوقت الحقيقي تقريبا من العناصر الحرجة من التمثيل الغذائي عضلة القلب في وقت واحد مع التقليدية التدابير الوظيفية.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل بشكل كامل من قبل برنامج NHLBI داخل الجدارية (المشروع # ZIA HL00460131).

Materials

BIOPAC data acquisition system BIOPAC MP150 Analog to digitial conversion
BIOPAC general purpose transducer amplifiers BIOPAC DA100C Pressure monitoring
BIOPAC System skin temperature amplifier BIOPAC SKT100B temperature monitoring
Compact Universal 1- and 2- Channel LED Controllers Mightex SLC-MA02-U External light source power supply
Disposable pressure sensors BIOPAC RX104A Pressure monitoring
Dual Syringe, Infusion Pump KdScientific KDS 200 / 200P LEGACY SYRINGE PUMP drug injection
Flow-through probes Transonic 4PXN perusate flow monitoring
Glass Syringe FORTUNA Optima 30 CC Air tight fluid injection
High power fiber-coupled LED white light source Mightex Type-A FCS-0000 External light source
Perfused heart system Radnoti 120101BEZ This system was heavily modified to provide adequate flow (see manuscript)
Phase fluorimeter Ocean Optics NeoFox-GT oxygen concentration
Pickup fiber optic Thor labs BF20HSMA01 Fiber for collecting transmitted light (pick up fiber)
PowerLab unit AD Instruments PowerLab 8/35 Analog to digitial conversion
Pressure transducers BIOPAC TSD104A pressure monitoring
Programming environment LABViEW N/A Software for driving spectrometer, digitiziing data and analysis. Code available on request
Rapid scanning spectrophotometer Ocean Optics QE65PRO Rapid scanning spectrometer for spectral analysis
Side firing fiber optic Polymicro Technologies Molex, LLC 18019 North 25th Av, Phoenic AZ 85023-1200 JTFLH200230500/1.5M  side firing fiber optic 200 microns core 
Sodium cyanide Sigma-Aldrich 380970 Metabolic inhibitor
Temperature probe BIOPAC TSD102A temperature monitoring
Tubing flow modules Transonic TS410 perusate flow monitoring
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arai, A. E., Kasserra, C. E., Territo, P. R., Gandjbakhche, A. H., Balaban, R. S. Myocardial oxygenation in vivo: optical spectroscopy of cytoplasmic myoglobin and mitochondrial cytochromes. American Journal of Physiology. 277, 683-697 (1999).
  2. Epstein, F. H., Balaban, R. S., Ross, B. D. Redox state of cytochrome aa3 in isolated perfused rat kidney. American Journal of Physiology. 243 (4), 356-363 (1982).
  3. Hassinen, I. E., Hiltunen, J. K., Takala, T. E. S. Reflectance spectrophotometric monitoring of the isolated perfused heart as a method of measuring the oxidation-reduction state of cytochromes and oxygenation of myoglobin. Cardiovascular Research. 15, 86-91 (1981).
  4. Makino, N., Kanaide, H., Yoshimura, R., Nakamura, M. Myoglobin oxygenation remains constant during the cardiac cycle. American Journal of Physiology. 245 (14), 237-243 (1983).
  5. Takahashi, E., Doi, K. Visualization of oxygen level inside a single cardiac myocyte. American Journal of Physiology. 268, 2561-2568 (1995).
  6. Heineman, F. W., Kupriyanov, V. V., Marshall, R., Fralix, T. A., Balaban, R. S. Myocardial oxygenation in the isolated working rabbit heart as a function of work. American Journal of Physiology. 262, 255-267 (1992).
  7. Arakaki, L. S., Burns, D. H., Kushmerick, M. J. Accurate myoglobin oxygen saturation by optical spectroscopy measured in blood-perfused rat muscle. Applied Spectroscopy. 61 (9), 978-985 (2007).
  8. Bose, S., French, S., Evans, F. J., Joubert, F., Balaban, R. S. Metabolic network control of oxidative phosphorylation: multiple roles of inorganic phosphate. Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39155-39165 (2003).
  9. Tamura, M., Oshino, N., Chance, B., Silver, I. A. Optical measurements of intracellular oxygen concentrations of rat heart in vitro. Archives of Biochemistry and Biophysics. 191, 18-22 (1978).
  10. Wright, T. J., Davis, R. W. Myoglobin oxygen affinity in aquatic and terrestrial birds and mammals. The Journal of Experimental Biology. 218, 2180-2189 (2015).
  11. Wright, T. J., Davis, R. W. Myoglobin extraction from mammalian skeletal muscle and oxygen affinity determination under physiological conditions. Protein Expression and Purification. 107, 50-55 (2015).
  12. Shibata, T., et al. Relationship between oxygen affinity and autoxidation of myoglobin. Inorganic Chemistry. 51 (21), 11955-11960 (2012).
  13. Kim, N., Ripple, M. O., Springett, R. Measurement of the mitochondrial membrane potential and pH gradient from the redox poise of the hemes of the bc1 complex. Biophysical Journal. 102 (5), 1194-1203 (2012).
  14. Oshino, N., Jamieson, D., Sugano, T., Chance, B. Mitochondrial function under hypoxic conditions: The steady states of cytochrome a,a3 and their relation to mitochondrial energy states. Biochimica et Biophysica Acta. 368, 298-310 (1974).
  15. Glancy, B., Willis, W. T., Chess, D. J., Balaban, R. S. Effect of calcium on the oxidative phosphorylation cascade in skeletal muscle mitochondria. Biochemistry. 52 (16), 2793-2809 (2013).
  16. Figulla, H. R., Hoffmann, J., Lubbers, D. W. Evaluation of reflection spectra of the isolated heart by multicomponent spectra analysis in comparison to other evaluating methods. Advances in Experimental Medicine and Biology. 169, 821-830 (1984).
  17. Hoffmann, J., Lubbers, D. W., Heise, H. M. Applicability of the Kubelka-Munk theory for the evaluation of reflectance spectra demonstrated for haemoglobin-free perfused heart tissue. Physics in Medicine and Biology. 43 (12), 3571-3587 (1998).
  18. Fabel, H., Lubbers, D. W. Measurements of Reflection Spectra of Beating Rabbit Heart in Situ. Biochemische Zeitschrift. 341 (4), 351 (1965).
  19. Schenkman, K. A., Beard, D. A., Ciesielski, W. A., Feigl, E. O. Comparison of buffer and red blood cell perfusion of guinea pig heart oxygenation. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 285 (5), 1819-1825 (2003).
  20. Femnou, A. N., et al. Intracardiac light catheter for rapid scanning transmural absorbance spectroscopy of perfused myocardium: measurement of myoglobin oxygenation and mitochondria redox state. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 313 (6), 1199-1208 (2017).
  21. Kuzmiak-Glancy, S., et al. Cardiac performance is limited by oxygen delivery to the mitochondria in the crystalloid-perfused working heart. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 314 (4), 704-715 (2018).
  22. Chess, D. J., et al. Optical spectroscopy in turbid media using an integrating sphere: mitochondrial chromophore analysis during metabolic transitions. Analytical Biochemistry. 439 (2), 161-172 (2013).
  23. Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. Multiparametric optical mapping of the Langendorff-perfused rabbit heart. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
  24. Coburn, R. F., Grubb, B., Aronson, R. D. Effect of cyanide on oxygen tension-dependent mechanical tension in rabbit aorta. Circulation Research. 44 (3), 368-378 (1979).
  25. Schenkman, K. A., Marble, D. R., Burns, D. H., Feigl, E. O. Myoglobin oxygen dissociation by multiwavelength spectroscopy. Journal of Applied Physiology. 82 (1), 86-92 (1997).
  26. Femnou, A. N., et al. Intracardiac light catheter for rapid scanning transmural absorbance spectroscopy of perfused myocardium: measurement of myoglobin oxygenation and mitochondria redox state. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 313 (6), 1199-1208 (2017).
  27. Giles, A. V., et al. Paradoxical Arteriole Constriction Compromises Cytosolic and Mitochondrial Oxygen Delivery in the Isolated Saline-Perfused Heart. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory. , (2018).
  28. Matthews, P. M., et al. A 31P-NMR study of some metabolic and functional effects of the inotropic agents epinephrine and ouabain, and the ionophore R02- 2985 (X537A) in the isolated, perfused rat heart. Biochimica et Biophysica Acta. 720, 163-171 (1982).
  29. Lewandowski, E. D., Damico, L. A., White, L. T., Yu, X. Cardiac responses to induced lactate oxidation: NMR analysis of metabolic equilibria. American Journal of Physiology. 269, 160-168 (1995).
  30. Lewandowski, E. D., et al. Multiplet structure of 13C NMR signal from glutamate and direct detection of tricarboxylic acid (TCA) cycle intermediates. Magnetic Resonance in Medicine. 35 (2), 149-154 (1996).
  31. Ball, D. R., et al. Hyperpolarized butyrate: a metabolic probe of short chain fatty acid metabolism in the heart. Magnetic Resonance in Medicine. 71 (5), 1663-1669 (2014).
  32. Mariotti, E., et al. Modeling non-linear kinetics of hyperpolarized [1-(13)C] pyruvate in the crystalloid-perfused rat heart. NMR in Biomedicine. 29 (4), 377-386 (2016).
  33. Pisarenko, O. I., Khlopkov, V. N., Ruuge, E. K. A 1H NMR study of succinate synthesis from exogenous precursors in oxygen-deprived rat heart mitochondria. Biochemistry International. 12 (1), 145-153 (1986).
  34. Kuzmiak-Glancy, S., et al. Cardiac performance is limited by oxygen delivery to the mitochondria in the crystalloid-perfused working heart. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 314 (4), 704-715 (2018).
  35. Schenkman, K. A., Marble, D. R., Burns, D. H., Feigl, E. O. Myoglobin oxygen dissociation by multiwavelength spectroscopy. American Journal of Physiology. 82 (1), 86-92 (1997).
  36. Beard, D. A., Schenkman, K. A., Feigl, E. O. Myocardial oxygenation in isolated hearts predicted by an anatomically realistic microvascular transport model. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 285 (5), 1826-1836 (2003).
  37. Paul, R. J., Bohr, D. E., Somlyo, A. P., Sparks, H. V. Section II: The Cardiovascular System, Vol II, Vascular Smooth Muscle. Handbook of Physiology. , 201-252 (1980).
  38. Feigl, E. O. Coronary physiology. Physiological Reviews. 63, 1-205 (1983).

Tags

Intra-cardiacSide-firingLight CatheterTransmural Absorbance SpectroscopyPerfused Mammalian HeartsMitochondrial MetabolismMyocardial FunctionFiber Optic CatheterMitral ValveLeft Ventricular Free WallRapid Scanning SpectrometerRoom Light ContaminationData AcquisitionChromophore Reference Spectra

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Femnou, A. N., Giles, A., Balaban, R. S. Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts. J. Vis. Exp. (147), e58992, doi:10.3791/58992 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image