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Bioengineering

Catetere leggero intra-cardiaco per il monitoraggio del metabolismo cellulare utilizzando la spettroscopia transmurale di riambente di cuori mammiferi perfusi

Published: May 12, 2019
doi:
10.3791/58992
, ,
1Laboratory of Cardiac Energetics, National Heart, Lung, and Blood Institute,National Institutes of Health, 2Department of Biomedical Engineering,The George Washington University

Summary

Qui introduciamo un metodo per utilizzare un catetere ottico intra-ventrico nei cuori perfusi per eseguire la spettroscopia di assorbimento attraverso la parete cardiaca. I dati ottenuti forniscono informazioni solide sulla tensione dell’ossigeno tissutale, nonché sull’utilizzo del substrato e sul potenziale della membrana contemporaneamente con misure di prestazione cardiaca in questa onnipresente preparazione.

Abstract

La spettroscopia di assorbimento del muscolo cardiaco fornisce una valutazione non distruttiva dell’ossigenazione citosolica e mitocondriale rispettivamente tramite mioglobina e assorbimento citocromo. Inoltre, possono essere stimati anche numerosi aspetti dello stato metabolico mitocondriale come il potenziale della membrana e l’ingresso del substrato. Per eseguire la spettroscopia ottica di trasmissione della parete cardiaca, un catetere in fibra ottica a fuoco laterale disponibile in commercio viene posizionato nel ventricolo sinistro del cuore perfuso isolato come fonte di luce. La luce che passa attraverso la parete cardiaca viene raccolta con una fibra ottica esterna per eseguire la spettroscopia ottica del cuore quasi in tempo reale. L’approccio di trasmissione evita numerose interferenze di dispersione superficiale che si verificano in approcci di riflessione ampiamente utilizzati. I cambiamenti negli spettri di assorbimento transmurale sono stati deconvolvi utilizzando una libreria di spettri di riferimento cromoforo, fornendo misure quantitative di tutti i cromofori cardiaci noti contemporaneamente. Questo approccio di deconvoluzione spettrale ha eliminato gli errori intrinseci che possono derivare dall’utilizzo di metodi comuni a doppia lunghezza d’onda applicati a spettri di assorbimento sovrapposti, oltre a fornire una valutazione quantitativa della bontà dell’adattamento. Un programma personalizzato è stato progettato per l’acquisizione e l’analisi dei dati, che ha permesso allo sperimentatore di monitorare lo stato metabolico della preparazione durante l’esperimento. Queste aggiunte relativamente semplici al sistema di perfusione cardiaca standard forniscono una visione unica dello stato metabolico della parete cardiaca, oltre alle misure convenzionali di contrazione, perfusione e estrazione substrato/ossigeno.

Introduction

La spettroscopia ad assorbimento ottico per il monitoraggio della biochimica degli organi intatta è un approccio ampiamente utilizzato a causa della sua natura intrinseca e non distruttiva1,2,3,4,5, 6,7,8,9. L’assorbimento della mioglobina fornisce una misura della tensione media citosolica dell’ossigeno10,11,12. I citocromi mitocondriali forniscono informazioni riguardanti l’ingresso del substrato a livello di flanape, il potenziale della membrana da citocromo bL:bH13e la consegna di ossigeno ai mitocondri nella cellula dall’ossidasi citocromatica (COX ) stato redox14. Glancy et al. ha dimostrato che le attività di ogni complessi possono essere determinate misurando il potenziale della membrana mitocondriale e il tasso metabolico15. Quindi, utilizzando la spettroscopia ottica, una grande quantità di informazioni può essere ottenuta senza la necessità di sonde esogene o di importanti modifiche degli attuali sistemi di studio. L’obiettivo di questo documento è quello di presentare un metodo robusto per raccogliere spettri ottici di trasmissione nei preparati cardiaci perfusi convenzionali con l’unica modifica importante nell’esecuzione di studi in un ambiente oscurato.

La spettroscopia di assorbimento della riflessione è stata utilizzata con successo per eseguire la spettroscopia ottica del cuore perfuso3,6,16,17,18,19 così come il cuore in vivo1. La spettroscopia di riflessione consiste nell’incidere sulla luce sulla superficie del cuore e nel raccogliere la luce dispersa nel cuore, nonché la luce riflessa diffusa e speculare. Pertanto, la luce raccolta in questo approccio è un composto di più meccanismi di dispersione e delle assorbizioni dei cromofori tissutali di interesse. A causa del movimento e della superficie complessa del cuore, il riflesso della luce dalla superficie del cuore è particolarmente problematico, alterando la profondità di penetrazione e la quantità di luce puramente riflessa.

I limiti della spettroscopia di assorbimento della riflessione sopra presentati sono stati risolti introducendo un catetere ottico nella cavità del ventricolo sinistro, permettendo la raccolta di luce trasmessa attraverso la parete libera del ventricolo sinistro20. I vantaggi della spettroscopia di trasmissione per questo tipo di studio sono stati apprezzati nei primi studi invasivi di Tamura et al.9 L’attuale implementazione fornisce un’analisi spettroscopia di assorbimento di trasmissione molto robusta del cuore intatto con per quanto riguarda l’ossigenazione citosolica e lo stato di mitocondri in una varietà di condizioni21. Questi studi iniziali hanno utilizzato un catetere appositamente fabbricato con un LED alimentato sulla punta orientato per generare un modello di cottura laterale di luce bianca attraverso il miocardio. Tuttavia, il catetere con punta a LED relativamente grande è adatto solo per l’uso su cuori di medie dimensioni (coniglio, porcellino d’India, ecc.) e richiede una fabbricazione personalizzata. Nello studio attuale, viene presentato un metodo di utilizzo di una fibra ottica a combustione laterale da 200 micron disponibile in commercio come guida luminosa. Invece di un LED cablato sulla punta, il catetere con la punta da 500 micro reindirizza la luce da una sorgente esterna aumentando la versatilità del sistema. Questo approccio consente l’uso di un’ampia gamma di sorgenti luminose esterne, tra cui laser per applicazioni come la spettroscopia a dispersione Raman. Per quantificare questi dati, viene presentata un’analisi spettrale completa online multicomponente utilizzando spettri di riferimento noti per migliorare l’accuratezza della determinazione spettroscopica dei cromofori cardiaci, come descritto in precedenza20,22. Il codice sorgente per questa analisi sarà fornito dagli autori su richiesta. Utilizzando questo approccio, le informazioni sulla biochimica cardiaca e sulla funzione mitocondriale possono essere ottenute contemporaneamente con i parametri funzionali cardiaci convenzionali con un impatto minimo o nulla sulla preparazione del cuore. Poiché il cuore dipende in modo critico dalla funzione mitocondriale e dalla consegna di ossigeno, questa aggiunta tecnica al classico sistema cardiaco perfuso migliorerà notevolmente l’interpretazione e l’utilità di questo importante modello di prestazioni cardiache.

Protocol

Tutti i protocolli sugli animali sono stati approvati dal National Heart, Lung, and Blood Institute Animal Care and Use Committee ed eseguiti in conformità con le linee guida descritte nella legge sulla cura e il benessere degli animali (7 USC 2142 – 13). 1. Sistema cardiaco perfuso e perfusate NOTA: Questa preparazione è molto simile alle pubblicazioni precedenti23. Fai 4 litri di Krebs-Henseleit perf modificato composto da (in mmol/L) 137.0 NaCl, 5.4 KCl, 1.8 CaCl2, 0.5 MgCl2, 1.0 Na2HPO4, 10.0 glucosio, 1.0 lattato e 10.0 HEPES. la perfusate a 7,4 a 37 gradi centigradi con NaOH e HCl. Filtrare il perfssuo attraverso una membrana di pori di 1 m. Sciacquare tutti i tubi e le camere del sistema cardiaco perfuso utilizzando e drenando acqua purificata attraverso il sistema. Trasferire il perfusate nel serbatoio e ossigenare con 100% O2 con il gorgogliatore mantenendo la temperatura a 37 gradi centigradi utilizzando un bagno d’acqua riscaldata circolante. Aggiungere 2 dei 12 filtri a membrana dei pori di 12 m e innescare il sistema con il perfusate durante la ricircolo in modalità Langendorff. Fissare un morsetto tubo sul tubo proprio sopra la cannula aortica e regolare la vite in modo che il flusso aortico scende a circa 10 mL / min. 2. Escissione e perfusione del Cuore di Coniglio Escissione cardiaca Anestesizzare i conigli bianchi maschi neozelandesi (circa 3 kg) tramite un’iniezione intramuscolare di 1,5 mL di miscela di ketamina/acepromazina (10:1). Circa 10-15 minuti dopo, somministrare il 3% di isoflurane per inalazione per un effetto anestetico completo. Confermare la corretta profondità di anestesia pizzicando la punta e quindi posizionare una linea nella vena dell’orecchio marginale per la somministrazione di farmaci successivi. Iniettare 1.500 unità (o 1,5 mL di 1.000 unità/mL) di Heparin e lasciare circolare per 3 minuti. Controllare la profondità corretta dell’anestesia e poi eutanasia con 6 mEq (o 3 mL di 2 mEq/mL) di KCl. Apri rapidamente il torace, individua l’apice del cuore e l’aorta. Rimuovere il cuore tagliando l’aorta il più lontano possibile dal cuore e tagliando le vene polmonari il più vicino possibile ai polmoni.NOTA: la rimozione dei polmoni in questa fase iniziale è diversa dalla precedente pubblicazione23, ma non ha un impatto sulla preparazione. Posizionare il cuore in un piccolo becher di perfusate (stesso perfusate come passo 1.3) seduto in un secchio di ghiaccio per il trasporto dalla chirurgia alla perfusione. Canonazione cardiaca Cannula e legare l’aorta in modo sicuro, assicurandosi di non includere bolle nella linea aortica. Avviare il flusso a 70 mmHg pressione di perfusione rimuovendo il morsetto tubo sulla linea aortica e mantenere questa pressione durante il resto dell’intervento chirurgico e canonato della nave. Separare l’arteria polmonare dall’aorta e da altri vasi e legiare la cava venaria e le vene polmonari. Rimuovere il grasso e il tessuto connettivo ancora presenti. Cannula l’arteria polmonare per fornire una misura della portata coronarica del peccato e della tensione dell’ossigeno. Scartare il flusso iniziale dal cuore (per circa 10 minuti) durante la preparazione per eliminare il sangue e detriti chirurgici. Dopo questo periodo, ricircolare il perfusate. 3. Posizionamento in fibra ottica side-firing Collegare il catetere in fibra ottica a una fonte di luce bianca LED accoppiata in fibra ad alta potenza per aiutare la visualizzazione e fornire la luce per la spettroscopia una volta nel cuore. Tagliare una piccola appendice dell’atrio sinistro, inserire il catetere nel ventricolo sinistro tramite la valvola mitrale, quindi ruotarlo per ottenere una parete libera di ventricolo sinistro illuminato. Posizionare la fibra ottica del pickup direttamente di fronte alla regione di massima illuminazione del ventricolo sinistro a circa 1 cm dal cuore. Collegare l’altra estremità della fibra di prelievo a uno spettrometro a scansione rapida. 4. Spettroscopia ottica Spegnere le luci nell’area sperimentale per ottenere completa oscurità. Avviare il programma personalizzato, incorporando i driver spettrometro per eseguire l’acquisizione dei dati e l’analisi in tempo reale della luce trasmessa.NOTA: una versione eseguibile della versione consolidata del programma di acquisizione e analisi spettrale viene fornita come file di codifica supplementare. Il codice sorgente è disponibile su richiesta degli autori. Naviga attraverso tutti i prompt, selezionando le opzioni per la modalità di acquisizione spettroscopia del cuore perfuso. Nella pagina successiva indicare se è in corso la raccolta dei dati ausiliari. Infine, immettere i parametri di acquisizione, inclusa la posizione di entrambi i cromofori di riferimento spettri e dati da salvare. Immettere una larghezza di banda di 490-630 nm. Immettere una frequenza di campionamento di 2 Hz (ad es. 2 campioni/sec). Raccogliere uno spettro di corrente scura, o luce zero, per correggere i livelli del segnale di fondo spegnendo la sorgente luminosa. Fare clic per selezionare i riferimenti cromofori che si desidera utilizzare nella routine di raccordo. Nella pagina Acquisisci dati regolare la posizione del catetere e della fibra di prelievo per massimizzare la luce trasmessa visualizzata sul software con particolare attenzione all’ampiezza del segnale nell’area di 500 nm, dove la mioglobina ossigenata ossigenato ad assorbimenti. Assicurarsi che la luce trasmessa non saturi il rilevatore nell’area di 600 nm. Assicurarsi che nessuna sorgente luminosa esterna contribuisca allo spettro raccolto disattivando l’illuminazione del catetere e verificando che non venga rilevata alcuna luce. Avviare la raccolta dei dati facendo clic sul pulsante Salva spettri. Fare clic su Imposta come controllo per visualizzare lo spettro di assorbimento delle differenze dagli spettri futuri allo spettro di “controllo” corrente. Eseguire qualsiasi perturbazione fisiologica come desiderato. Protocollo 1: Effetto del cianuro sulle prestazioni cardiache e sull’assorbimento del cromoforo Smettere di ricircolare il liquido dalla perfusione cardiaca. Utilizzando una pompa a siringa, iniettare cianuro (da 2,5 a 75 mM a pH 7) a velocità diverse nel perfusate appena prima della cannula aortica per raggiungere le concentrazioni desiderate di cianuro (0,025 a 1 mM, calcolate dalla portata aortica) nel perfusate scorrevole nel monitorare la funzione cardiaca e le proprietà ottiche. Fermare la pompa della siringa di cianuro quando gli effetti sul flusso coronarica e la frequenza cardiaca insieme alla trasmissione ottica attraverso la parete cardiaca sono in stato costante. Protocollo 2: Ischemia/Ipossia Fermare l’infusione di cianuro. Dopo 5 minuti passare il gas bollente da 100% ossigeno a 100% azoto per rimuovere l’ossigeno dal sistema. Dopo circa 10 minuti, arrestare il flusso per simulare una condizione ischemica/ipossica totale. 5. Analisi dei dati spettrali Eseguire il programma in modalità di analisi del cuore perfuso. Selezionare lo spettrometro appropriato. Immettere il percorso del file di dati e il file degli spettri di riferimento e selezionare la sorgente di luce del catetere, che carica lo spettro pre-salvato della sorgente luminosa del catetere. Selezionare Lettura dati collocazione. Selezionate Imposta lunghezza inmorta (Set Min) e Lunghezza onda massima (Max Wavelength). Immettere la larghezza di banda per l’analisi dei dati come 490-630 nm. Selezionare Torna al menu principale. Selezionare Leggi riferimenti. Confermare gli spettri di riferimento da utilizzare nell’analisi. Selezionare Torna al menu principale. Selezionare Punti temporali nel menu principale. Selezionare un punto temporale T0 come controllo e impostare l’intervallo su 100 punti. Selezionare un punto temporale T1 come periodo sperimentale in un intervallo di 100 punti. Osservate lo spettro delle differenze grezze nella scheda Media Abs. Selezionare Calcola coefficienti di adattamento, quindi fare clic sulla scheda Coefficienti di adattamento per osservare il percorso temporale dell’adattamento degli spettri di riferimento. Tornare al menu principale e selezionare Calcola differenza Abs. Selezionare T0 e l’istruzione T1 in tutte le posizioni. Osservare lo spettro adattato nella finestra Spettro differenza e gli elementi di raccordo nella finestra Peso riferimento. Ripetere questa procedura per confrontare altri punti temporali nell’esperimento. Tornare al menu principale. Salvare i dati e l’analisi in un foglio di calcolo digitando il nome desiderato e selezionando Salva dati per un’ulteriore analisi con altri programmi.NOTA: se non viene digitato alcun nome, il report viene salvato con lo stesso nome del file di input. Il report viene salvato in una cartella denominata File di analisi di Excel, che si trova nella stessa cartella del file di input originale.

Representative Results

Il sistema utilizzato è un sistema cardiaco perlano piccolo animale fuori dagli scaffali, ma è stato pesantemente modificato per l’uso con un cuore di coniglio. Le modifiche sono state principalmente per aumentare la dimensione del foro di tutti i tubi per assicurare un’adeguata consegna del flusso al cuore di coniglio. Grande attenzione è stata fatta per assicurare, alle pressioni di perfusione utilizzate, la portata del sistema di perfusione nativo ha superato il flusso con il cuore attaccato di almeno 5 volte. Sono stati posizionati in parallelo 2-12 filtri a membrana dei pori tra la pompa del fluido e la camera aortica di trappola a bolle per rimuovere eventuali detriti dal cuore. Luce trasmessa dal Cuore del ConiglioFigura 1 presenta lo spettro del catetere (Figura 1A) e lo spettro grezzo della luce trasmessa dalla parete libera cuore coniglio (Figura 1B). Questi dati rivelano una grande attenuazione della luce nella regione blu dello spettro, tuttavia le bande di assorbimento dalla mioglobina e le citocchemimimi mitocondriali possono essere osservate direttamente tra 490 e 580 nm nell’inserto. È importante in questi studi assicurare che nella regione venga rilevata una luce trasmessa sufficiente da 490 a 630 nm per ottenere informazioni sui cromofori cardiaci metabolicamente reattivi. Il posizionamento delle fibre esterne e interne viene regolato prima di salvare i dati per massimizzare l’intensità della luce ma non saturare il rivelatore nella regione di 625 nm. Riferimento Ridotto meno Spettri ossidizzati di Cromofori di riferimento nel cuore.Figura 2 presenta gli spettri di riferimento utilizzati per adattarsi agli spettri di differenza raccolti in questi studi. Questi riferimenti includono mioglobina, citocromia aa3 (in alternativa citocromo un605 e citocromo un607, a seconda del tipo di perturbazione22), citochrome a580, citocromo bL, citocromo bH , citocromo c, citocromo c1, FAD, una rappresentazione di assorbimento della luce incidente (denotato I0, che viene utilizzato per tenere conto della luce setacciata, cioè i fotoni che hanno attraversato il tessuto senza essere assorbiti), e una linea (con pendenza e intercettare per tenere conto della dispersione, non mostrato figura 2). Alcuni spettri sono rumorosi, in quanto la concentrazione del materiale di riferimento puro era molto bassa22. Il corso di tempo degli spettri di riferimento si adatta durante l’esperimento totaleLa figura 3 rappresenta il percorso temporale di un esperimento tipico calcolato nel passaggio 5.15 del protocollo. Questo consiste in una fase di controllo, seguita da una fase di iniezione di cianuro, seguita da un lavaggio del cianuro, seguita da una fase di deossigenazione, e infine ischemia. I cambiamenti nei singoli cromofori (mioglobina, citocromia aa3e citocromo c) nel tempo vengono tracciati nel tempo insieme alla portata coronarica. Il cambiamento di densità ottica di ogni cromoforo è stimato moltiplicando il coefficiente di adattamento ottenuto dalla routine lineare dei minimi quadrati e dal picco rappresentativo del cromoforo (o dalla massima assorbimento di detto cromoforo). Ad esempio, per la mioglobina, il coefficiente di adattamento del riferimento alla mioglobina viene moltiplicato per il valore dello spettro di riferimento della mioglobina a 580 nm. Si noti la rapida ossigenazione della mioglobina per l’aggiunta di cianuro è abbinata all’aumento del flusso, ma è prima della significativa riduzione dei citocchici. Questo effetto è parzialmente recuperato con il lavaggio del cianuro. Infine, la piena riduzione dei citocromi e la deossigenazione della mioglobina si ottiene con l’ischemia. Questi dati dimostrano che i dati dinamici riguardanti lo stato metabolico del cuore possono essere facilmente ottenuti con questa metodologia. La posizione degli spettri utilizzati per gli spettri di differenza sono contrassegnati in questo percorso temporale come: Linea di base C, iniezione di cianuro di CN, CNW cyanide Washout, H N2 Hypoxia (azoto bollente nel perfusati invece di ossigeno), e HI Nessun flusso ischemia (no perfusate che scorre attraverso il cuore). Spettro di differenza di trattamento del cianuro rispetto al controllo e adattamento dello spettro delle differenze di cianuro dal cuore di coniglio.Per ottenere uno spettro di differenza, vengono sottratti due spettri assoluti. Ogni spettro assoluto si ottiene prendendo una media di molti (tipicamente 100) spettri per ottimizzare il rapporto segnale-rumore. Figura 4 A rappresenta lo spettro di differenza del cuore trattato di controllo (C) e cianuro (CN). Utilizzando gli spettri di riferimento descritti nella Figura 2, viene calcolato lo spettro di adattamento. Lo spettro residuo è la sottrazione dell’adattamento dai dati grezzi. Lo stesso schema viene utilizzato per tutte le successive presentazioni spettrali. Figura 4 B presenta le ampiezza degli spettri degli spettri di riferimento (illustrati nella Figura 2) utilizzati per adattarsi alla figura 4A. Forti aumenti di assorbimento della maggior parte dei citocchi sono osservati come il flusso di elettroni lungo la catena citocromatica è stato bloccato dal cianuro nello stato stabile. Inoltre, l’assorbimento della mioglobina ossigenata è aumentata quando il consumo di ossigeno è stato eliminato dal cianuro. Figura 4 C presenta gli spettri di differenza e l’adattamento dello spettro di differenza da CNW e CN, rivelando l’inversione parziale dell’effetto cianuro. Ciò è stato ottenuto selezionando i punti temporali nel passaggio 5.18 del protocollo, spostando T0 nella CNW e T1 nell’area CN del corso cronologico. Figura 4 D presenta lo spettro di differenza di HI e C, che rappresenta lo stato completamente deossigenato e ridotto del citosol e dei mitocondri rispetto alla condizione di controllo. Anche in questo caso, questo è stato eseguito al passaggio del protocollo 5.18, spostando T0 a C e T1 a HI. Corso temporale iniziale degli effetti del cianuro sul flusso coronario e sui cromoforiFigura 5 A mostra un esempio dell’avvio dell’effetto cianuro sul tessuto. Le vestibilità per mioglobina, citocromia un605 e citochrome c insieme al flusso coronarica sono presentati per un singolo cuore. Questi corsi temporali sono stati creati al passaggio del protocollo 5.15 per l’esperimento del cianuro. La differenza individuale rispetto alla linea di base (posizione 1) è illustrata nella Figura 5B. Gli spettri sono stati generati dal numero di posizione corrispondente (1-4) nel corso cronologico. Questo è stato possibile al passo del protocollo 5.18, dove T0 era sempre in posizione 1, e successivamente diversi spettri (2–4) sono stati creati spostando T1 alla posizione 2, 3 e 4 rispettivamente. Un po ‘sorprendente è stata l’osservazione che il flusso e l’ossigenazione della mioglobina sono aumentati prima di cambiamenti significativi nello stato di redox citocromatico. L’inizio dei cambiamenti nel flusso e nell’assorbimento dei cromofori è stato stimato mediante estrapolazione lineare del tasso iniziale di variazione dalla linea di base. Utilizzando questo approccio, e impostando il cambiamento nel flusso coronario come tempo zero, l’aumento dell’ossigenazione della mioglobina ha iniziato 1,71 min – 0,39 min dopo il cambiamento di flusso, mentre l’a605 citocromo e l’assorbimento citocromatico erano quasi identici ma molto più lenti a 4,24 min – 0,76 min e 4,34 min – 0,77 min rispettivamente (n . 8). Questi dati suggeriscono che il cianuro rilassa il tono vascolare24 prima che si verifichi un importante cambiamento nello stato metabolico del muscolo cardiaco. Questo effetto è probabilmente causato da cianuro che incontra il muscolo vascolare prima di raggiungere la dose efficace intorno ai miociti cardiaci. Stime dell’ossigenazione della mioglobina nei cuori di controlloUtilizzando i dati di cianuro come una stima dell’ossigenazione totale della mioglobina e dei dati sull’ischemia per la mioglobina completamente deossigenata, stimiamo che in condizioni di controllo la mioglobina fosse solo dell’88,2% – 1,0% (n – 10) ossigenata, coerente con studi precedenti20 , 21 Mieto , 25. Figura 1 : Spettri del catetere ottico a cottura laterale. (A) Questo è uno spettro della luce emessa dalla fonte di luce remota attraverso il catetere rilevato con la fibra di prelievo a circa 1 cm dal catetere. In questa geometria, il cuore è assente e l’intensità della sorgente luminosa è sintonizzata in modo che il rivelatore non si saturi. (B) Il catetere che spara lateralmente viene inserito nel ventricolo sinistro e la luce trasmessa dal cuore viene raccolta e mostrata. L’inserto mostra la regione da 400 a 580 nm espansa, rivelando la complessa trasmissione della luce da questa regione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2 : spettri di riferimento dei cromofori cardiaci utilizzati per l’adattamento spettrale. Gli spettri sono stati raccolti tramite una varietà di metodi22 e sono di ridotto – ossidato (per i citocromi) e deossigenato – ossigenato (per la mioglobina). Per I0, lo spettro in Figura 1A viene semplicemente convertito in un termine di assorbimento per rendere il riferimento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3 : cambiamenti di flusso e ottici nel tempo. Il cambio di densità ottica di ogni cromoforo di ogni cromoforo è semplicemente lo spettro del cromoforo individuale montato alla sua massima assorbimento. Le frequenze massime di assorbimento erano come descritto in precedenza20,26. Il corso di tempo presentato è per un esperimento, che mostra una linea di base, seguita da iniezione di cianuro (0,10 mM al massimo flusso di perfusate), lavaggio del cianuro, ipossia di azoto eseguita sostituendo l’ossigeno con l’azoto e quindi completa l’ischemia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4 : Spettri di differenza adattati di varie condizioni. (A) Spettro dell’iniezione di cianuro meno la linea di base. Viene anche tracciato lo spettro di adattamento ottenuto dalla routine meno quadrata. Lo spettro residuo è la differenza tra gli spettri grezzi e quelli adatti. (B) Gli spettri di riferimento utilizzati per creare l’adattamento presentato nella Figura 4A. Il programma scala i riferimenti in figura 2 al loro contributo relativo nell’attuale spettro di differenze. (C) Come in A, ma mostrando lo spettro di differenza di lavaggio rispetto all’iniezione di cianuro. (D) Come in A, ma mostrando lo spettro di differenza di ischemia rispetto alla linea di base. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5 : Alta risoluzione temporale dell’effetto di infusione di cianuro su citocromi selezionati, mioglobina e flusso cardiaco. (A) Corso temporale del flusso cardiaco, deoxymyoglobin, citocromia ridottaa 605e riduzione citocromo c. I numeri si riferiscono alla posizione degli spettri presi rispetto al basale nella Figura 5B. (B) Differenza spettrale per le 4 posizioni etichettate nella Figura 5A rispetto al controllo (posizione 1). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

La preparazione isolata retrogrado o lavoro cuore perfuso è un pilastro nello studio della fisiologia cardiaca, nonché lo studio preclinico di tecniche e farmaci sul cuore. La chiave per il suo utilizzo è stata la facilità di preparazione, le caratteristiche funzionali robuste e il controllo dei parametri sperimentali, nonché la capacità di misurare molti parametri funzionali del cuore pulsante. La spettroscopia ad assorbimento ottico fornisce informazioni sull’ossigenazione dei tessuti e sulle attività metaboliche dei mitocondri. La spettroscopia ottica ha condotto principalmente negli studi isolati sul cuore perfuso nella modalità di riflettanza che è difficile interpretare a causa di complicazioni di movimento e diffusione della luce.

Abbiamo introdotto la spettroscopia ottica a trasmissione a parete del ventricolo (VWTOS) per fornire un metodo robusto per monitorare i cromofori metabolici dei tessuti cardiaci. In una pubblicazione precedente, abbiamo dimostrato che un LED cablato alla punta del cavo coassiale20 crea una fonte di luce laterale intracardiaca unica che può essere utilizzata per i cuori perfusi VWTOS. La cottura laterale si riferisce alla proiezione della luce perpendicolare all’asse lungo del catetere, ideale per illuminare la parete libera del ventricolo. Il catetere LED era abbastanza piccolo da non influire sulla funzione cardiaca, ma richiedeva una fabbricazione specializzata in laboratorio. Lo studio attuale presenta l’uso di un catetere commerciale da 500 micron che può essere accoppiato a qualsiasi fonte di luce compatibile con le fibre ottiche. Questi cateteri ottici a cottura laterale sono stati sviluppati commercialmente per l’ablazione laser perpendicolarmente al lungo asse della fibra. Naturalmente, stiamo usando la potenza luminosa molto inferiore a quella richiesta per la fotoablazione. Fibre più piccole sono disponibili per l’uso su preparazioni più piccole come il cuore di topo perfuso27. Questo sistema a fibra ottica ha fornito un’adeguata illuminazione attraverso la parete cardiaca nella gamma di lunghezze d’onda dove i cromofori cardiaci assorbono (450-630 nm). Utilizzando una fibra ottica pick-up all’esterno del cuore, l’assorbimento di mioglobina e mitocondri citoccheche può essere monitorato con un’eccellente risoluzione temporale e spettrale (vedi Figura 5). L’approccio a fibra ottica a fuoco laterale presenta diversi vantaggi rispetto al catetere LED per VWTOS, tra cui un profilo trasversale molto più piccolo del catetere che riduce al minimo l’impatto del catetere sul cuore, riducendo più flessibile l’impatto sulla valvola cardiaca e prestazioni di ventricolo, nessuna connessione elettrica che può corto nel perfusate salina, e infine un catetere che utilizza una fonte di luce esterna che aumenta la flessibilità della selezione della fonte di luce per VWTOS.

A causa della forte assorbimento del cuore al di sotto di 490 nm, è difficile generare molte informazioni sulla banda Soret dei citocchi nell’area di 410-445 nm o NADH a 340 nm. Pertanto, l’ampia assorbanza del FAD a 450 nm è l’assorbimento di frequenza più basso che si osserva, anche se l’intero picco di assorbimento di questo cromoforo non è campionato. Utilizzando VWTOS il rapporto segnale/rumore è molto alto in quanto l’intera parete viene campionata in contrasto con la spettroscopia di riflessione superficiale, comunemente usata20, che campiona solo la superficie del cuore con numerosi problemi di dispersione. VWTOS campionamento l’intera parete del cuore è più analogo alle misure di spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMRS) di molti metaboliti cardiaci come 31P rilevato agconsina trefosfato e creatina fosfato28, 13C rilevato metaboliti etichettati29,30 comprese le etichette iperpolarizzate31,32e 1H rilevati metaboliti33. Poiché il VWTOS può essere condotto utilizzando dispositivi non magnetici, è completamente fattibile che NMR e VWTOS possano essere condotti contemporaneamente. VWTOS non si limita ai cromofori endogeni e potrebbe essere utilizzato per monitorare l’assorbimento dalle sonde ottiche per il pH, Ca2oe il potenziale della membrana plasmatica.

Usiamo 2 Hz (cioè 2 campioni/sec) che fornisce un eccellente segnale a spettro singolo al rumore. Anche se si possono ottenere tassi di campionamento più elevati che consentano l’analisi del ciclo cardiaco, studi precedenti hanno dimostrato che non c’è nessun battito per battere la variazione nell’assorbimento dei cromofori, quindi nessuno sforzo per raccogliere selettivamente la luce come funzione del ciclo cardiaco era fatto34. A causa della geometria VWTOS, il rilevamento della luce dipende meno dal movimento dei tessuti rispetto ai metodi di riflessione, poiché gli eventi di dispersione della superficie complessi vengono eliminati. Troviamo che il movimento grave può interrompere queste misure, ma l’analisi spettrale in tempo reale rivela rapidamente transizioni spettrali incoerenti con le transizioni di cromoforo dei tessuti. Ancora una volta, questo si verifica solo quando il cuore si allontana grossolanamente dalla fibra di raccolta riducendo drasticamente la quantità di luce trasmessa raccolta.

I dati VWTOS vengono analizzati utilizzando la completa routine di raccordo spettrale basata su una libreria di riferimento di spettri di cromofori cardiaci e lo spettro della sorgente luminosa come descritto in precedenza20,22,27, 35 con un semplice approccio lineare dei minimi quadrati. Questa procedura di adattamento spettrale ha compensato la sovrapposizione dello spettro di assorbimento e non si basa su lunghezze d’onda “iso-amidiche”. Questa analisi dello spettro completo elimina gli artefatti associati all’analisi del fascio doppio comune (cioè a due lunghezze d’onda)1,3,6 che si è rivelato problematico20. Il vantaggio aggiuntivo dell’analisi spettrale completa è la generazione di una bontà di vestibilità dai residui, non disponibile nei protocolli a doppio fascio.

In questo studio, ci siamo concentrati sull’effetto del cianuro sulle proprietà ottiche del cuore. Poiché il cianuro blocca l’ossidasi citocromatica, inibisce il consumo di ossigeno e si traduce essenzialmente in una riduzione netta di tutti i citocchi mentre gli elettroni si ritrovano nella catena citocromatica. Tuttavia, il potenziale della membrana apparentemente rimane alto, come i cambiamenti redox in bL e bH sono molto piccoli rispetto al citocromo c13. Con la cessazione del consumo di ossigeno, la tensione di ossigeno nel tessuto dovrebbe avvicinarsi al perfusate e abbiamo notato un aumento precoce della mioglobina ossigenata con cianuro coerente con la nozione che il cuore perfuso salino, anche in retrogrado perfusione modalità, non è completamente ossigenante mioglobina nel citosol19,20,21,36. Confrontando l’effetto massimo del cianuro sulla mioglobina ossigenata con lo spettro completamente deossigenato ottenuto con ischemia rivela un’ossigenazione della mioglobina di soli circa l’88%, coerente con studi precedenti.

È importante notare in questo studio che gli effetti del cianuro sull’ossigenazione della mioglobina e la riduzione del citocromo sono stati risolti temporalmente. È sorprendente che gli effetti del cianuro siano stati osservati per la prima volta sul flusso coronarica e sulla mioglobina prima che siano osservati grandi cambiamenti nello stato di redox citocromi del cuore. Il primo aumento marcato nel flusso suggerisce che un effetto sul muscolo liscio arterioso24,37 può verificarsi prima che si osservino gli effetti metabolici lordi nelle cellule cardiache. L’aumento del flusso, potenzialmente con una modesta diminuzione della respirazione indotta da cianuro, probabilmente si traduce nell’immediato aumento della mioglobina ossigenata causata dall’aumento della fornitura di ossigeno. Con la diffusione dell’inibizione del cianuro ai miociti, si osserva un ulteriore aumento del flusso coronario (vedi la regione contrassegnata 3 nella Figura 5a), probabilmente guidata da numerosi fattori metabolici38. Il grande impatto precoce del cianuro sul flusso suggerisce che il metabolismo del muscolo liscio vascolare può essere più potente nell’alterare il tono vascolare rispetto al metabolismo dei miociti. Questi dati supportano la nozione consolidata che la mioglobina ha un’affinità molto inferiore per l’ossigeno rispetto al COX, anche nel cuore intatto, poiché l’ossigenazione della mioglobina si è verificata ben prima dei cambiamenti nello stato di redox dei mitocondri (Figura 5). Questo alto livello di mioglobina disossigenata sotto controllo è coerente con studi precedenti che suggeriscono che il cuore perfuso salina isolato può essere parzialmente ipossico anche in condizioni di controllo9,19, 20,21,27,36, sottolineando l’importanza di monitorare l’ossigenazione dei tessuti cardiaci quando si utilizza questo importante modello di fisiologia cardiaca.

Qui presentiamo i dettagli sperimentali per condurre la spettroscopia ad assorbimento della trasmissione sul cuore perfuso isolato. Abbiamo adattato con successo questa tecnica per l’uso sui cuori dal coniglio al mouse utilizzando una sottile fibra ottica intracardiaca che spara lateralmente. Utilizzando lo stato dell’arte routine di raccordo spettrale completo, la complessa interazione ottica dei cromofori cardiaci può essere facilmente estratta fornendo, una misura quasi in tempo reale di elementi critici del metabolismo miocardico contemporaneamente con convenzionale misure funzionali.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato pienamente supportato dal programma intramurale NHLBI (Progetto – EI-E HL00460131).

Materials

BIOPAC data acquisition system BIOPAC MP150 Analog to digitial conversion
BIOPAC general purpose transducer amplifiers BIOPAC DA100C Pressure monitoring
BIOPAC System skin temperature amplifier BIOPAC SKT100B temperature monitoring
Compact Universal 1- and 2- Channel LED Controllers Mightex SLC-MA02-U External light source power supply
Disposable pressure sensors BIOPAC RX104A Pressure monitoring
Dual Syringe, Infusion Pump KdScientific KDS 200 / 200P LEGACY SYRINGE PUMP drug injection
Flow-through probes Transonic 4PXN perusate flow monitoring
Glass Syringe FORTUNA Optima 30 CC Air tight fluid injection
High power fiber-coupled LED white light source Mightex Type-A FCS-0000 External light source
Perfused heart system Radnoti 120101BEZ This system was heavily modified to provide adequate flow (see manuscript)
Phase fluorimeter Ocean Optics NeoFox-GT oxygen concentration
Pickup fiber optic Thor labs BF20HSMA01 Fiber for collecting transmitted light (pick up fiber)
PowerLab unit AD Instruments PowerLab 8/35 Analog to digitial conversion
Pressure transducers BIOPAC TSD104A pressure monitoring
Programming environment LABViEW N/A Software for driving spectrometer, digitiziing data and analysis. Code available on request
Rapid scanning spectrophotometer Ocean Optics QE65PRO Rapid scanning spectrometer for spectral analysis
Side firing fiber optic Polymicro Technologies Molex, LLC 18019 North 25th Av, Phoenic AZ 85023-1200 JTFLH200230500/1.5M  side firing fiber optic 200 microns core 
Sodium cyanide Sigma-Aldrich 380970 Metabolic inhibitor
Temperature probe BIOPAC TSD102A temperature monitoring
Tubing flow modules Transonic TS410 perusate flow monitoring
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References

  1. Arai, A. E., Kasserra, C. E., Territo, P. R., Gandjbakhche, A. H., Balaban, R. S. Myocardial oxygenation in vivo: optical spectroscopy of cytoplasmic myoglobin and mitochondrial cytochromes. American Journal of Physiology. 277, 683-697 (1999).
  2. Epstein, F. H., Balaban, R. S., Ross, B. D. Redox state of cytochrome aa3 in isolated perfused rat kidney. American Journal of Physiology. 243 (4), 356-363 (1982).
  3. Hassinen, I. E., Hiltunen, J. K., Takala, T. E. S. Reflectance spectrophotometric monitoring of the isolated perfused heart as a method of measuring the oxidation-reduction state of cytochromes and oxygenation of myoglobin. Cardiovascular Research. 15, 86-91 (1981).
  4. Makino, N., Kanaide, H., Yoshimura, R., Nakamura, M. Myoglobin oxygenation remains constant during the cardiac cycle. American Journal of Physiology. 245 (14), 237-243 (1983).
  5. Takahashi, E., Doi, K. Visualization of oxygen level inside a single cardiac myocyte. American Journal of Physiology. 268, 2561-2568 (1995).
  6. Heineman, F. W., Kupriyanov, V. V., Marshall, R., Fralix, T. A., Balaban, R. S. Myocardial oxygenation in the isolated working rabbit heart as a function of work. American Journal of Physiology. 262, 255-267 (1992).
  7. Arakaki, L. S., Burns, D. H., Kushmerick, M. J. Accurate myoglobin oxygen saturation by optical spectroscopy measured in blood-perfused rat muscle. Applied Spectroscopy. 61 (9), 978-985 (2007).
  8. Bose, S., French, S., Evans, F. J., Joubert, F., Balaban, R. S. Metabolic network control of oxidative phosphorylation: multiple roles of inorganic phosphate. Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39155-39165 (2003).
  9. Tamura, M., Oshino, N., Chance, B., Silver, I. A. Optical measurements of intracellular oxygen concentrations of rat heart in vitro. Archives of Biochemistry and Biophysics. 191, 18-22 (1978).
  10. Wright, T. J., Davis, R. W. Myoglobin oxygen affinity in aquatic and terrestrial birds and mammals. The Journal of Experimental Biology. 218, 2180-2189 (2015).
  11. Wright, T. J., Davis, R. W. Myoglobin extraction from mammalian skeletal muscle and oxygen affinity determination under physiological conditions. Protein Expression and Purification. 107, 50-55 (2015).
  12. Shibata, T., et al. Relationship between oxygen affinity and autoxidation of myoglobin. Inorganic Chemistry. 51 (21), 11955-11960 (2012).
  13. Kim, N., Ripple, M. O., Springett, R. Measurement of the mitochondrial membrane potential and pH gradient from the redox poise of the hemes of the bc1 complex. Biophysical Journal. 102 (5), 1194-1203 (2012).
  14. Oshino, N., Jamieson, D., Sugano, T., Chance, B. Mitochondrial function under hypoxic conditions: The steady states of cytochrome a,a3 and their relation to mitochondrial energy states. Biochimica et Biophysica Acta. 368, 298-310 (1974).
  15. Glancy, B., Willis, W. T., Chess, D. J., Balaban, R. S. Effect of calcium on the oxidative phosphorylation cascade in skeletal muscle mitochondria. Biochemistry. 52 (16), 2793-2809 (2013).
  16. Figulla, H. R., Hoffmann, J., Lubbers, D. W. Evaluation of reflection spectra of the isolated heart by multicomponent spectra analysis in comparison to other evaluating methods. Advances in Experimental Medicine and Biology. 169, 821-830 (1984).
  17. Hoffmann, J., Lubbers, D. W., Heise, H. M. Applicability of the Kubelka-Munk theory for the evaluation of reflectance spectra demonstrated for haemoglobin-free perfused heart tissue. Physics in Medicine and Biology. 43 (12), 3571-3587 (1998).
  18. Fabel, H., Lubbers, D. W. Measurements of Reflection Spectra of Beating Rabbit Heart in Situ. Biochemische Zeitschrift. 341 (4), 351 (1965).
  19. Schenkman, K. A., Beard, D. A., Ciesielski, W. A., Feigl, E. O. Comparison of buffer and red blood cell perfusion of guinea pig heart oxygenation. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 285 (5), 1819-1825 (2003).
  20. Femnou, A. N., et al. Intracardiac light catheter for rapid scanning transmural absorbance spectroscopy of perfused myocardium: measurement of myoglobin oxygenation and mitochondria redox state. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 313 (6), 1199-1208 (2017).
  21. Kuzmiak-Glancy, S., et al. Cardiac performance is limited by oxygen delivery to the mitochondria in the crystalloid-perfused working heart. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 314 (4), 704-715 (2018).
  22. Chess, D. J., et al. Optical spectroscopy in turbid media using an integrating sphere: mitochondrial chromophore analysis during metabolic transitions. Analytical Biochemistry. 439 (2), 161-172 (2013).
  23. Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. Multiparametric optical mapping of the Langendorff-perfused rabbit heart. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
  24. Coburn, R. F., Grubb, B., Aronson, R. D. Effect of cyanide on oxygen tension-dependent mechanical tension in rabbit aorta. Circulation Research. 44 (3), 368-378 (1979).
  25. Schenkman, K. A., Marble, D. R., Burns, D. H., Feigl, E. O. Myoglobin oxygen dissociation by multiwavelength spectroscopy. Journal of Applied Physiology. 82 (1), 86-92 (1997).
  26. Femnou, A. N., et al. Intracardiac light catheter for rapid scanning transmural absorbance spectroscopy of perfused myocardium: measurement of myoglobin oxygenation and mitochondria redox state. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 313 (6), 1199-1208 (2017).
  27. Giles, A. V., et al. Paradoxical Arteriole Constriction Compromises Cytosolic and Mitochondrial Oxygen Delivery in the Isolated Saline-Perfused Heart. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory. , (2018).
  28. Matthews, P. M., et al. A 31P-NMR study of some metabolic and functional effects of the inotropic agents epinephrine and ouabain, and the ionophore R02- 2985 (X537A) in the isolated, perfused rat heart. Biochimica et Biophysica Acta. 720, 163-171 (1982).
  29. Lewandowski, E. D., Damico, L. A., White, L. T., Yu, X. Cardiac responses to induced lactate oxidation: NMR analysis of metabolic equilibria. American Journal of Physiology. 269, 160-168 (1995).
  30. Lewandowski, E. D., et al. Multiplet structure of 13C NMR signal from glutamate and direct detection of tricarboxylic acid (TCA) cycle intermediates. Magnetic Resonance in Medicine. 35 (2), 149-154 (1996).
  31. Ball, D. R., et al. Hyperpolarized butyrate: a metabolic probe of short chain fatty acid metabolism in the heart. Magnetic Resonance in Medicine. 71 (5), 1663-1669 (2014).
  32. Mariotti, E., et al. Modeling non-linear kinetics of hyperpolarized [1-(13)C] pyruvate in the crystalloid-perfused rat heart. NMR in Biomedicine. 29 (4), 377-386 (2016).
  33. Pisarenko, O. I., Khlopkov, V. N., Ruuge, E. K. A 1H NMR study of succinate synthesis from exogenous precursors in oxygen-deprived rat heart mitochondria. Biochemistry International. 12 (1), 145-153 (1986).
  34. Kuzmiak-Glancy, S., et al. Cardiac performance is limited by oxygen delivery to the mitochondria in the crystalloid-perfused working heart. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 314 (4), 704-715 (2018).
  35. Schenkman, K. A., Marble, D. R., Burns, D. H., Feigl, E. O. Myoglobin oxygen dissociation by multiwavelength spectroscopy. American Journal of Physiology. 82 (1), 86-92 (1997).
  36. Beard, D. A., Schenkman, K. A., Feigl, E. O. Myocardial oxygenation in isolated hearts predicted by an anatomically realistic microvascular transport model. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 285 (5), 1826-1836 (2003).
  37. Paul, R. J., Bohr, D. E., Somlyo, A. P., Sparks, H. V. Section II: The Cardiovascular System, Vol II, Vascular Smooth Muscle. Handbook of Physiology. , 201-252 (1980).
  38. Feigl, E. O. Coronary physiology. Physiological Reviews. 63, 1-205 (1983).

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Femnou, A. N., Giles, A., Balaban, R. S. Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts. J. Vis. Exp. (147), e58992, doi:10.3791/58992 (2019).
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