浸透哺乳動物の心臓のトランスムラル吸光分光法を用いた細胞代謝モニタリングのための心臓内側発射光カテーテル

使用されるシステムは、市販の小動物灌流心臓システムであるが、ウサギの心臓との使用のために大幅に変更された。変更は、主にウサギの心臓への十分な流れ送達を保証するために、すべてのチューブのボアサイズを増加させました。使用される灌流圧で、ネイティブ灌流システムの流量が少なくとも5倍の心臓を付着した流れを超えたように細心の注意が払われました。2〜12 μmの細孔膜フィルターは、心臓から任意の破片を除去するために、流体ポンプと大動脈プリロードバブルトラップチャンバの間に平行に配置されました。 ウサギの心臓から透過光図1は、カテーテルのスペクトル(図1A)とウサギの心臓自由壁からの透過光の生スペクトルを提示する(図1B)。これらのデータは、スペクトルの青色領域における光の非常に大きな減衰を明らかにするが、ミオグロビンとミトコンドリアシトクロムからの吸光のバンドは、挿入物中の490と580 nmの間で直接観察することができる。これらの研究では、代謝的に応答性の心臓染色体に関する情報を得るために、490から630 nmの領域で十分な透過光が検出されることを保証することが重要です。外部および内部繊維の位置は、光強度を最大化するためにデータを保存する前に調整されますが、625 nm領域の検出器は飽和しません。 参照減少マイナス酸化スペクトルの心臓の参照染色体。図2は、これらの研究で収集された差スペクトルに適合するために使用される基準スペクトルを提示する。これらの参照には、ミオグロビン、シトクロムaa3(代わりにシトクロムa605およびシトクロムa607、摂動22のタイプに応じて)、シトクロムa580、シトクロムbL、シトクロムb Hが含まれる。,シトクロムc,シトクロムc1,FAD,入射光の吸光度表現(I0を示す)、すなわち、吸収されずに組織を通過した光子)とライン(可変で)図 2に示す図に示されていない、散乱を考慮して傾斜と切片を行います。いくつかのスペクトルは、純粋な基準材料の濃度が非常に低かったように、騒々しいです22. 全実験中の基準スペクトル適合の時間経過図3は、プロトコルのステップ5.15で計算された典型的な実験の時間経過を表す。これは、コントロールフェーズ、続いてシアン化物注入段階、続いてシアン化物洗浄、脱酸素段階、および最後に虚血から構成される。個々の染色体(ミオグロビン、シトクロムaa3、およびシトクロムc)の時間の経過とともに、冠状動脈流量と共に時間の経過とともにプロットされます。各染色体の光学密度変化は、線形最小二乗ルーチンおよび染色体の代表的なピーク(または前記染色体の最大吸光度)から得られた適合係数を乗算することによって推定される。例えば、ミオグロビン参照の適合係数に580nmのミオグロビン参照スペクトルの値を乗算します。シアン化物の添加に対するミオグロビンの急速な酸素化は、流れの増加と一致するが、シトクロムの有意な減少の前にある。この効果は、シアン化物の洗浄で部分的に回復されます。最後に、シトクロムの完全な減少とミオグロビンの脱酸素が虚血で得られる。これらのデータは、心臓の代謝状態に関する動的データが、この方法論で容易に得ることができることを示している。差分スペクトルに使用されるスペクトルの位置は、この時間コースでマークされています: Cベースライン, CNシアン化物注射, CNWシアン化物ウォッシュアウト, H N2低酸素症 (酸素の代わりに噴泡化している窒素), HI No流虚血症 (いいえ心臓を流れるパーフューサート)。 ウサギの心臓からのシアン化物治療の対照と適合の差スペクトル差スペクトルを得るために、2つの絶対スペクトルを減算する。各絶対スペクトルは、信号対雑音比を最適化するために、多くの(通常は100)スペクトルの平均を取ることによって得られます。図 4Aは、治療された心臓の対照(C)とシアン化物(CN)の差スペクトルを表す。図2で概説した基準スペクトルを用いて、適合スペクトルが計算される。残留スペクトルは、生データからの適合値の減算です。同じスキームは、後続のすべてのスペクトル・プレゼンテーションに使用されます。図 4Bは、図4Aに適合するために使用される基準スペクトル(図2に示す)のスペクトル振幅を示す。シトクロム鎖下の電子の流れが定常状態のシアン化物によって遮断されたため、ほとんどのシトクロムの吸光度の強い増加が観察される。さらに、シアン化物によって酸素の消費が排除されるにつれて、酸素化ミオグロビンの吸光度が増加した。図 4CはCNWおよびCNからの差スペクトルと適合の差を提示し、シアン化物効果の部分的反転を明らかにする。これは、プロトコルステップ5.18でタイムポイントを選択し、T0をCNWおよびT1をタイムコースのCN領域に移動することによって達成されました。図 4Dは、シトゾールとミトコンドリアの完全脱酸素および還元状態と制御状態を表すHIおよびCの差スペクトルを提示する。繰り返しますが、これはプロトコルステップ5.18で行われ、T0をCとT1をHIに移動しました。 冠動脈流と染色体に対するシアン化物効果の初期時間経過図 5Aは、組織に対するシアン化物効果の開始の例を示す。ミオグロビン、シトクロムa605およびシトクロムcの適合性は、冠状動脈流と共に単一の心臓のために提示される。これらの時間コースは、シアン化物実験のためのプロトコルステップ5.15で作成されました。個人差とベースライン (位置 1) を図 5Bに示します。スペクトルは、タイムコースの対応する位置番号(1-4)から生成された。これはプロトコルステップ5.18で行われ、T0は常に位置1にあり、その後、T1を位置2、3、4に移動することによって異なるスペクトル(2-4)が作成されました。やや驚いたのは、シトクロム酸化還元状態の有意な変化の前に流れとミオグロビン酸素化が増加したという観察であった。流れおよび発色体吸光度の変化の開始は、ベースラインからの初期変化率の線形外挿によって推定された。このアプローチを用いて、冠動脈流の変化を時間ゼロとして設定すると、ミオグロビン酸素化の増加は流れの変化後に1.71分±0.39分を開始し、シトクロムa605とシトクロムc吸光度はほぼ同じであったが、4.24分±でははるかに遅かった。0.76分、4.34分±0.77分(n= 8)。これらのデータは、シアン化物が心筋代謝状態の大きな変化が起こる前に血管緊張24を緩和することを示唆している。この効果は、心臓筋細胞の周りの有効な用量に達する前に血管平滑筋に遭遇シアン化物によって引き起こされる可能性が高い. コントロール心臓におけるミオグロビン酸素化の推定値シアン化物データを完全に脱酸素ミオグロビンの総ミオグロビン酸素化と虚血データの推定値として使用し、ミオグロビンは88.2%±1.0%(n=10)のみであり、以前の研究20と一致したと推定する。,21歳,25. 図 1:サイド焼成光学カテーテルのスペクトル。(A)これは、カテーテルから約1cmのピックアップ繊維で検出されたカテーテルを通して遠隔光源から放射された光のスペクトルである。このジオメトリでは、心臓が存在せず、検出器が飽和しないように光源の強度が調整されます。(B)左心室に側面焼成カテーテルを挿入し、心臓からの透過光を集め、示す。インサートは、400~580 nm領域が拡大され、この領域からの光の複雑な透過を明らかにする。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 2:スペクトルフィッティングに使用される心臓染色体の参照スペクトル。スペクトルは、様々な方法22を介して収集され、還元された – 酸化(シトクロム用)および脱酸素 – 酸素化 (ミオグロビン用).I0の場合、図 1Aのスペクトルは、単に吸光度項に変換して参照を作成します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 3: 時間の経過に合ったフローと光学の変化。各染色体の光学密度変化(ΔOD)は、単にその最大吸光度で適合した個々の染色体のスペクトルです。最大吸光度周波数は、前述の20,26であった。提示された時間コースは、ベースラインを示す1つの実験のために、続いてシアン化物注入(最大パーフューサートフローで0.10 mM)、シアン化物洗浄、窒素低酸素、窒素を窒素に置き換えることによって行われ、その後、虚血を完了する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 4:様々な条件の適合差スペクトル。(A)シアン化物注入のスペクトルからベースラインを差し引いたスペクトル。最小正方形ルーチンから得られた適合スペクトルもプロットされます。残留スペクトルは、生スペクトルとフィットスペクトルの差です。(B) 図4Aに示す適合体の作成に使用される基準スペクトル。プログラムは、図 2 の参照を、現在の差スペクトルにおける相対的な寄与度にスケーリングします。(C)Aと同じであるが、洗い流しとシアン化物注射の差スペクトルを示す。(D)Aと同じであるが、虚血とベースラインの差スペクトルを示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 5: 選択したシトクロム、ミオグロビンおよび心臓の流れに対するシアン化物注入効果の高い時間分解能。(A)心流の時間経過、デオキシミオグロビン、減少シトクロムa605、および減少シトクロムc.数値は、図5Bのベースラインに対して採取されたスペクトルの位置を指す。(B) 図5Aに標識された4つの位置とコントロール(位置1)の差分スペクトル。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。