JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Perfkullanılmış Mammalin kalpleri transmural absorbance spektroskopisi kullanarak hücresel metabolizmayı Izleme için kalp içi yan ateş ışık kateter

Published: May 12, 2019
doi:
10.3791/58992
, ,
1Laboratory of Cardiac Energetics, National Heart, Lung, and Blood Institute,National Institutes of Health, 2Department of Biomedical Engineering,The George Washington University

Summary

Burada, kalp duvarında emici spektroskopisi gerçekleştirmek için perfkullanılmış kalplerinde intra ventrikül optik kateter kullanmanın bir yöntemini tanıtıyoruz. Elde edilen veriler, doku oksijen geriliminin yanı sıra substrat kullanımı ve membran potansiyeli ile aynı anda bu her yerde yapılan hazırlıkta kardiyak performans önlemleri ile ilgili güçlü bilgiler sağlar.

Abstract

Kardiyak kas emilbance spektroskopisi, sırasıyla miyoglobin ve sitokrom emici yoluyla sitomik ve mitokondriyal oxygenasyon ile tahribatsız değerlendirme sağlar. Ek olarak, membran potansiyeli ve substrat girişi gibi mitokondriyal metabolik durumun sayısız yönleri de tahmin edilebilir. Kardiyak duvar iletim optik spektroskopisi gerçekleştirmek için, ticari olarak kullanılabilir bir yan ateş optik fiber kateter izole perfüvenli kalbin sol ventrikül bir ışık kaynağı olarak yerleştirilir. Kalp duvarından geçen ışık, kalp optik spektroskopisi ile yakın gerçek zamanlı olarak gerçekleştirmek için harici bir optik fiber ile toplanır. İletim yaklaşımı yaygın olarak kullanılan yansıma yaklaşımlar meydana gelen sayısız yüzey saçılma girişim önler. Transmural emici Spectra değişiklikleri aynı anda tüm bilinen kardiyak chromophores nicel önlemler sağlayan, bir kromofor referans Spectra kütüphanesi kullanılarak deconvolved edildi. Bu spektral deconvolution yaklaşım, ortak çift dalga boyu yöntemleri çakışan emici Spectra uygulanan kullanarak neden olabilir iç hataları ortadan, yanı sıra uygun iyilik nicel bir değerlendirme sağladı. Özel bir program, deney sırasında hazırlık metabolik durumunu izlemek için araştırmacı izin veri edinme ve analiz için tasarlanmıştır. Standart kalp perfüzyon sistemi bu nispeten basit eklemeler kasılma, perfüzyon ve substrat/oksijen ekstraksiyon geleneksel önlemleri ek olarak kalp duvarının metabolik durumu içine benzersiz bir fikir sağlar.

Introduction

Bozulmamış organ biyokimyası izleme için optik emici spektroskopisi, içsel, yıkıcı olmayan doğası nedeniyle yaygın olarak kullanılan bir yaklaşımdır1,2,3,4,5, 6,7,8,9. Myoglobin emici ortalama sitosolik oksijen gerilimi10,11,12bir ölçmek sağlar. Mitokondriyal sitokromes, flavins seviyesinde substrat girişine, sitokrom bL: bH13‘ ten membran potansiyeline ve sitokrom oksidaz HÜCRESINDEKI mitokondri (Cox) ‘ e oksijen teslimine ilişkin bilgi sağlar. ) redoks durumu14. Glancy ve ark. her kompleksleri faaliyetlerinin mitokondriyal membran potansiyeli ve metabolizma oranı15ölçerek belirlenebilir göstermiştir. Bu nedenle, optik spektroskopisi kullanarak, eksojen problar veya mevcut çalışma sistemlerinin önemli modifikasyonları olmadan bilgi zenginliği elde edilebilir. Bu makalenin amacı, karanlık bir ortamda çalışmalar gerçekleştiren tek büyük modifikasyon ile konvansiyonel perfkullanılmış kalp preparatlarında iletim optik Spectra toplamak için sağlam bir yöntem sunmak için.

Yansıtıcı Absorpsiyon spektroskopisi, perfkullanılmış kalp3,6,16,17,18,19 optik spektroskopisi gerçekleştirmek için başarıyla kullanılmıştır. kalp olarak vivo1. Yansıtma spektroskopisi, kalp yüzeyinde ışık alan ve kalbin yanı sıra diffüler ve lekeli yansıyan ışık ile dağılmış ışığı toplayarak oluşur. Böylece, bu yaklaşımda toplanan ışık, birden fazla saçılma mekanizmasının yanı sıra, faiz emici doku kroromophore bir Bileştir. Kalbin hareket ve karmaşık yüzeyi nedeniyle, kalbin yüzeyinin ışık yansıması özellikle sorunlu, penetrasyon derinliği ve tamamen yansıyan ışık miktarını değiştirerek.

Yukarıda sunulan yansıma emilimi spektroskopisinin sınırlamaları, sol ventrikül boşluğuna bir optik kateter getirerek, sol ventrikül serbest duvar20‘ de iletilen ışık koleksiyonuna izin vererek çözülmüştür. Bu tür bir çalışma için iletim spektroskopisinin faydaları Tamura ve al.9 tarafından erken invaziv çalışmalarda takdir edildi mevcut uygulama ile bozulmamış kalbin çok sağlam bir iletim Absorpsiyon spektroskopisi analizi sağlar çeşitli koşullar altında sitosolik oksijenasyon ve mitokondri redoks devlet açısından21. Bu ilk çalışmalar, miyokard yoluyla beyaz ışık bir yan ateş deseni oluşturmak için odaklı bir LED ile özel olarak fabrikasyon kateter kullandı. Ancak, nispeten büyük LED uçlu kateter sadece orta boy kalpleri (tavşan, kobay, vb) ve gerekli özel imalat kullanımı için uygundur. Mevcut çalışmada, bir ışık kılavuzu olarak ticari olarak kullanılabilir 200 mikron çekirdekli yan ateş optik fiber kullanma yöntemi sunulmaktadır. Ucu kablolu LED yerine, 500-Micro ucu olan kateter, sistemin çok yönlülüğünü artıran bir dış kaynaktan ışığı yönlendirir. Bu yaklaşım Raman saçılma spektroskopisi gibi uygulamalar için lazerler de dahil olmak üzere çok çeşitli dış ışık kaynaklarının kullanılmasına olanak sağlar. Bu verileri ölçmek için, kardiyak chromophorların spektroskopik belirlenmesi doğruluğunu artırmak için bilinen referans spektrumları kullanarak bir online tam çok bileşenli spektral analiz daha önce açıklanan olarak sunulmuştur,20,22. Bu analiz için kaynak kodu talep üzerine yazarlar tarafından sağlanacaktır. Bu yaklaşımı kullanarak, kardiyak Biyokimya ve mitokondriyal fonksiyon hakkında bilgi, kalp preparat üzerinde az veya hiç etkisi olmayan konvansiyonel kardiyak fonksiyonel parametreler ile aynı anda elde edilebilir. Kalp mitokondriyal fonksiyon ve oksijen teslim kritik olarak bağımlı olduğu gibi, klasik perfkullanılmış kalp sistemi bu teknik ek büyük ölçüde kardiyak performans bu önemli modelin yorumu ve yarar geliştirir.

Protocol

Tüm hayvan protokolleri Ulusal Kalp, akciğer ve kan Enstitüsü hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve hayvan bakımı ve refah Yasası (7 USC 2142 § 13) açıklanan yönergelere uygun olarak gerçekleştirilir. 1. yalıtılmış Perfüküler kalp sistemi ve Perfusate Not: Bu hazırlık önceki yayınlar için çok benzer23. 4 litre modifiye Krebs-Henseleit perfuzatta oluşan (mmol/L) 137,0 NaCl, 5,4 KCL, 1,8 CAcl2, 0,5 MgCl2, 1,0 na2HPO4, 10,0 glikoz, 1,0 lakdamak ve 10,0 HEPES olun. pH perfuzatta 7,4 için 37 ° c NaOH ve HCL ile. Perfuzatta 1 μm gözenek membran ile filtreleyin. Sistem aracılığıyla arıtılmış suyu çalıştırarak ve boşaltarak perfkullanılan kalp sisteminin tüm tüpler ve odaları durulayın. Perfusat ‘ı tankına aktarın ve% 100 O2 ile oksijen ile sıcak sirkülasyon su banyosunu kullanarak 37 °c ‘ de sıcaklık korurken bubbler ile. 12 μm gözenek membran filtreleri 2 ekleyin ve langendorff modunda reirculating ederken perfuzatta ile sistem Prime. Aort kanülünün hemen üstünde tüpün üzerine bir tüp kelepçe takın ve aort akışının yaklaşık 10 mL/dak ‘ye düşmesi için vidayı ayarlayın. 2. tavşan kalp eksizyonu ve perfüzyon Kalp eksizyonu Anestezize erkek Yeni Zelanda beyaz tavşan (yaklaşık 3 kg) üzerinden bir 1,5 mL intramusküler enjeksiyonu ketamin/Acepromazin karışımı (10:1). Yaklaşık 10 – 15 dakika sonra, tam bir anestezik etki için inhalasyon yoluyla% 3 isofluran yönetin. Parmak pinching tarafından anestezi uygun derinliği onaylayın ve daha sonra sonraki ilaçların uygulanması için marjinal kulak ven bir çizgi yerleştirin. Heparin 1.500 birimler (veya 1,5 mL 1.000 birimler/mL) enjekte ve 3 dakika boyunca dolaşmaya izin. Çift anestezi derinliği kontrol edin ve sonra 6 mEq (veya 3 mL 2 mEq/mL) KCl ile ötenize. Hızla göğsü açın, kalbin tepe ve aort bulun. Kalbinden mümkün olduğunca uzak aortu keserek ve akciğerleri mümkün olduğunca yakın olarak pulmoner damarların kesilmesi ile kalbi çıkarın.Not: Bu erken aşamada akciğerlerin çıkarılması önceki yayından farklıdır23 ama hazırlık üzerinde etkisi yoktur. Beyin perfüzyon küçük bir kabı (adım 1,3 olarak aynı perfuzatta) bir kova buzun içinde cerrahiden Perfüzyona ulaşım için oturan kalp yerleştirin. Kalp kanülasyon Cannulate ve aort güvenli, herhangi bir baloncuk aort hattında dahil etmek değil emin olun kravat. Aort hattında boru kelepçesini kaldırarak 70 mmHg perfüzyon basıncında akışı başlatın ve cerrahi ve damar kanülasyon geri kalanı sırasında bu baskıyı koruyun. Pulmoner arter aort ve diğer damarlardan ayırın ve vena cavae ve pulmoner venler indirgeme uzman. Yağ ve bağ dokusu hala mevcut çıkarın. Pulmoner arter koroner sinüs akış oranı ve oksijen gerilimi bir ölçmek sağlamak için cannulate. Kan ve cerrahi enkaz ortadan kaldırmak için hazırlık sırasında kalp (yaklaşık 10 dakika) ilk akışını atın. Bu dönemden sonra, perfusat reirculate. 3. yan-ateşleme fiber optik yerleştirme Bir kez kalp spektroskopisi için ışık sağlamak yanı sıra görselleştirme yardımcı olmak için yüksek güçlü fiber bağlantılı LED beyaz ışık kaynağına fiber optik kateter bağlayın. Sol Atriyumun küçük bir uzantının kesilmesi, kateteri mitral vana üzerinden sol ventrikül içine yerleştirin, sonra ışıklı bir sol ventrikül serbest duvara ulaşmak için döndürün. Kalp yaklaşık 1 cm sol ventrikül maksimum aydınlatma bölgenin karşısında doğrudan pikap fiber optik konumlandırın. Pickup lifin diğer ucunu hızlı bir tarama spektrometresi ile bağlayın. 4. optik spektroskopisi Tam karanlığı elde etmek için deneysel alandaki ışıkları kapatın. Veri edinme ve iletilen ışığın gerçek zamanlı analizini gerçekleştirmek için Spektrometre sürücülerini içeren özel programı başlatın.Not: spektral edinme ve analiz programının birleştirilmiş sürümünün çalıştırılabilir bir sürümü, ek kodlama dosyası olarak sağlanır. Kaynak kodu yazarlar için istek tarafından kullanılabilir. Perfüze kalp spektroskopisi edinme modu için seçenekleri seçerek tüm istemler arasında gezinmek. Sonraki sayfada, yardımcı veri toplama oluşmasını olup olmadığını belirtin. Son olarak, her iki chromophores referans spektrum ve kaydedilecek veri konumu dahil olmak üzere edinme parametrelerini girin. 490 – 630 nm ‘lik bir bant genişliği girin. 2 Hz (örn. 2 numune/sn) örnekleme hızını girin. Işık kaynağını kapatarak arka plan sinyali düzeylerini düzeltmek için karanlık bir akım veya sıfır ışık, spektrum toplayın. Montaj yordamında kullanılmak üzere istenilen kroromophore referanslarını seçmek için tıklayın. Veri edinme sayfasında, 500 Nm bölgesindeki sinyal genliğini belirli bir dikkat ile yazılım üzerinde görüntülenen iletilen ışığı maksimize etmek için kateter ve pikap lifinin konumunu ayarlayın, nerede oksijenli miyoglobin Absorbanlar gözlenmelidir. 600 Nm bölgesinde iletilen ışığın dedektörü doyurmaz olduğundan emin olun. Herhangi bir dış ışık kaynağının, kateter ışıklandırmasını kapatarak ve artık ışık algılanmadığından emin olmak için toplanan spektrumuna katkı sağlamadığı. Spectra kaydet düğmesini tıklatarak veri koleksiyonunu başlatın. Mevcut “kontrol” spektrumuna gelecekteki spektrumundan farkı emici spektrum görüntülemek için kontrol olarak set tıklayın. İstediğiniz gibi herhangi bir fizyolojik pertürasyon gerçekleştirin. Protokol 1: siyanürün kardiyak performans ve Kroromophore emilimi üzerine etkisi Kalp perfüzyon sıvı yeniden sirkülasyon durdurun. Bir şırınga pompası kullanarak, siyanür enjekte (2,5 için 75 mm pH 7) farklı oranlarda perfuzatta hemen önce aort kanül istenen siyanür konsantrasyonları elde etmek için (0,025 için 1 mm, aort debisi hesaplanan) kalp içine akan perfusat kalp fonksiyonu ve optik özellikleri izleme. Kalp duvarı aracılığıyla optik iletim ile birlikte koroner akış ve kalp hızı üzerindeki etkileri sabit durumda olduğunda siyanür şırınga pompası durdurun. Protokol 2: Iskemi/Hipxia Siyanür infüzyonu durdurun. 5 dakika sonra köpürme gazı geçiş 100% oksijen için 100% azot sistemden oksijen kaldırmak için. Yaklaşık 10 dakika sonra, toplam iskemik/hypoxic koşulu simüle etmek için akışı durdurun. 5. spektral veri analizi Perfüze kalp analiz modunda programı çalıştırın. Uygun Spektrometre seçin. Veri dosyası yolu ve referans spektrum dosyasını girin ve kateter ışık kaynağının önceden kaydedilmiş spektrumunu yükleyen kateter ışık kaynağını seçin. Okuma depo gözü verileriniseçin. Min ve maksimum dalga boyu Ayarla ‘yı seçin. Veri analizinin bant genişliğini 490 – 630 nm olarak girin. Ana menüye dönseçeneğini belirleyin. Okuma başvuruları’nı seçin. Analiz kullanmak için referans spektrumunun onaylayın. Ana menüye dönseçeneğini belirleyin. Ana menüde zaman noktalarını seçin. Seçin bir T0 zaman noktası denetim olarak ve 100 puan aralığını ayarlayın. 100 puan aralığında deneysel dönem olarak bir T1 zaman noktası seçin. Ortalamasız ABS. Spectrum sekmesindeki ham fark spektrumuna uyun. Uygun katsayıları hesapla ‘yı seçin ve ardından referans spektrumunun uygun zaman seyrini gözlemlemek Için fit katsayıları sekmesine tıklayın. Ana menüye dönün ve fark ABS ‘yi hesapla’yı seçin. Tüm konumlarda T0 ve ΔT1 öğesini seçin. Referans ağırlığı penceresindeki fark spektrum penceresinde ve sığdırma elemanlarına takılan spektrumunu inceleyin. Denemede diğer zaman noktalarını karşılaştırmak için bu yordamı yineleyin. Ana menüyedönün. İstediğiniz adı yazarak ve diğer programlarla daha fazla analiz için veri kaydet ‘i seçerek bir Elektronik Tablo raporunda veri ve analiz kaydedin.Not: hiçbir ad yazılmışsa, rapor giriş dosyası ile aynı adla kaydedilir. Rapor, özgün giriş dosyası ile aynı klasörde bulunan Excel çözümleme dosyalarıadlı bir klasöre kaydedilir.

Representative Results

Kullanılan sistem bir raf küçük hayvan perfüzyon kalp sistemi kapalı ama ağır bir tavşan kalbi ile kullanılmak üzere değiştirildi. Değişiklikler öncelikle tavşan kalbine yeterli akış teslim sağlamak için tüm tüpün delik boyutunu artırmak için oldu. Kullanılan perfüzyon basınçları, doğal perfüzyon sisteminin akış oranı en az 5 kat bağlı kalp ile akışını aştı sağlamak için büyük bir bakım yapılmıştır. 2 – 12 μm gözenek membran filtreleri, sıvı pompası ve aort önyükleme kabarcık tuzak odası arasında paralel olarak, kalbinden herhangi bir enkaz çıkarmak için yerleştirilir. Tavşan kalbi iletilen ışıkŞekil 1 kateterin spektrumunu sunar (Şekil 1A) ve tavşan kalbi serbest duvarından iletilen ışığın ham spektrumunu (Şekil 1B). Bu veriler spektrumun mavi bölgesinde ışığın çok büyük bir zayıflatması ortaya koymaktadır, ancak miyoglobin ve mitokondriyal sitokromlardan emilme bantları doğrudan 490 ve 580 Nm arasında eklenir. Bu çalışmalarda, metabolize duyarlı kardiyak chromophores hakkında bilgi almak için 490 ila 630 nm bölgede yeterli iletilen ışık tespit edilir sağlamak için önemlidir. Dış ve iç liflerin konumlandırılması, ışık yoğunluğunu maksimize etmek ancak 625 nm bölgesinde dedektörü doyurmak için veri kaydetmeden önce ayarlanır. Referans azaltılmış eksi oksitlenmiş spektrum referans Kroromophores kalbinden.Şekil 2 bu çalışmalarda toplanan fark spektrumları sığdırmak için kullanılan referans spektrumları sunar. Bu referanslar arasında myoglobin, sitokrom AA3 (alternatif olarak sitokrom a605 ve sitokrom a607, pertürme22tipine bağlı olarak), sitokrom a580, sitokrom bL, sitokrom bH , sitokrom c, sitokrom c1, fad, olay ışık emici bir temsili (ı0, hangi eleme ışık için hesap için kullanılan, yani, doku emilen olmadan gitti fotonlar), ve bir çizgi (değişen ile , Şekil 2′ de gösterilmez). Bazı Spectra gürültülü, saf referans malzemenin konsantrasyonu çok düşük olduğu gibi22. Referans spektrumunun zaman kursu toplam deney sırasında uyuyorŞekil 3 , protokol 5,15 adımda hesaplanan tipik bir denemenin zaman seyrini temsil eder. Bu bir kontrol aşaması, bir siyanür enjeksiyon aşaması, ardından bir siyanür yıkanma, ardından bir Deoksijenasyon faz ve sonunda iskemi oluşur. Zaman içinde bireysel chromophores (miyoglobin, sitokrom AA3ve sitokrom c) değişiklikleri zaman içinde koroner akış oranı ile birlikte çizilir. Her bir kroromophore optik yoğunluk değişikliği doğrusal en az kareler rutin elde fit katsayısı çarpılarak tahmin edilir ve kromofor temsilcisi zirve (ya da en fazla emici kromofor söyledi). Örneğin, miyoglobin için, miyoglobin referansının fit katsayısı 580 nm ‘de miyoglobin referans spektrumunun değeriyle çarpılır. Cyanamid ilavesi için miyoglobin hızlı oksijenasyon akış artışı ile eşleştirilir ancak sitokorların önemli azalma önce olduğunu unutmayın. Bu efekt, siyanür yıkılması ile kısmen kurtarılır. Son olarak, miyoglobin sitokominin tam olarak azaltılması ve deoxygenasyonu iskemi ile elde edilir. Bu veriler, kalbin metabolik durumu ile ilgili dinamik verilerin Bu metodoloji ile kolayca elde edilebileceğini göstermektedir. Fark Spectra için kullanılan spektrumunun konumu bu zaman kursu olarak işaretlenir: C taban çizgisi, CN siyanür enjeksiyonu, CNW siyanür Washout, H N2 hipoksi (nitrojen oksijen yerine perfusat bubbled olmak), ve HI Hayır akış iskemi (Hayır kalbinden akan perfuzatta). Fark spektrum siyanür tedavi karşı kontrol ve fit siyanür fark Spectrum gelen tavşan kalp.Bir fark spektrumunu elde etmek için iki mutlak Spectra çıkarılır. Her mutlak spektrum, sinyal gürültü oranı optimize etmek için birçok (genellikle 100) spektrum ortalama alarak elde edilir. Şekil 4 A kontrol (C) ve SIYANÜR (CN) tedavi kalp fark spektrumunu temsil eder. Şekil 2′ de özetlenen referans spektrumunu kullanarak, uygun spektrum hesaplanır. Kalıntı spektrum ham verilerden uygun çıkarma olduğunu. Aynı düzen, sonraki tüm spektral sunumlar için kullanılır. Şekil 4 B , Şekil 4A’ya uyacak şekilde kullanılan referans spektrumunun ( Şekil 2’ de gösterilen) spektrumları genlikleri sunar. Sitokrom zincirindeki elektronların akışı, sabit durumda siyanür tarafından engellendiği için, çoğu ürün tarafından emilme sırasında güçlü artışlar görülür. Buna ek olarak, oksijenli miyoglobin emilimine oksijeni tüketiminin siyanür ile ortadan kaldırılmasına neden oldu. Şekil 4 C , siyanür efektinin kısmi tersine çevrilmesini açığa çıkaran, CNW ve CN ‘den fark spektrumunun fark spektrumunu ve Sığını sunar. Bu zaman noktaları protokol adım 5,18, taşıma T0 için CNW ve T1 zaman kursun CN bölgeye seçerek gerçekleştirilir. Şekil 4 D , kontrol durumuna karşı sitosol ve mitokondri tam deoxygenated ve azaltılmış durumu temsil HI ve C, fark spektrum sunar. Yine, bu protokol adım 5,18, t0 C ve T1 için HI hareket yapılmıştır. Koroner akış ve chromophores üzerinde siyanür etkileri ilk kez dersŞekil 5 A , dokuda siyanür etkisinin başlaması örneği gösterir. Myoglobin için uygun, sitokrom a605 ve sitokrom c koroner akış ile birlikte tek bir kalp için sunulmaktadır. Bu zaman kursları siyanür deney için protokol adım 5,15 oluşturuldu. Taban çizgisine (pozisyon 1) karşı bireysel fark Şekil 5B’de gösterilir. Spectra zaman kursu üzerinde ilgili pozisyon numarası (1-4) oluşturuldu. Bu protokol adım 5,18, burada T0 her zaman 1 konumunda yapıldı ve daha sonra farklı spektrumları (2 – 4) T1 2, 3 ve 4 konumuna sırasıyla taşıyarak oluşturuldu. Sitokrom redoks durumundaki önemli değişikliklerden önce akımının ve miyoglobin oksijeninin arttığı gözlem biraz şaşırtıcı oldu. Akış ve kromofor emici değişikliklerin başlatılması temel değişim başlangıç oranının doğrusal extrapolasyon ile tahmin edildi. Bu yaklaşımı kullanarak ve zaman sıfır olarak koroner akışta değişiklik ayarı, miyoglobin oksijenasyon artış 1,71 dk ± 0,39 dk akış değişikliği sonra başlatılan, sitokrom a605 ve sitokrom c emici neredeyse aynı ama çok daha yavaş iken 4,24 dk ± 0,76 dk ve 4,34 dk ± 0,77 dk, sırasıyla (n = 8). Bu veriler, kardiyak kas metabolik durumunda büyük bir değişiklik oluşmadan önce siyanürlerin vasküler sesi24 rahatlatır olduğunu düşündürmektedir. Bu etkiye büyük olasılıkla kardiyak miyositler etrafında etkili dozda ulaşmadan önce vasküler pürüzsüz Kas karşılaşma siyanür kaynaklanır. Kontrol kalplerinde myoglobin oksijenasyon tahminleriSiyanür verilerini Total miyoglobin oksijenasyon ve tam deoxygenated miyoglobin için iskemi verilerinin bir tahmini olarak kullanarak, miyoglobin kontrol koşullarında sadece 88,2% ± 1,0% (n = 10) oxygenated, önceden çalışmalar ile tutarlı olduğunu tahmin20 , 21 , 25 yaşında. Şekil 1 : Yan ateş eden optik kateter spektrumları. (A) bu, uzak ışık kaynağından yayılan ışığın bir spektrumundan, kateter üzerinden yaklaşık 1 cm ‘lik çekme lifiyle tespit edilen kateter aracılığıyla yapılır. Bu geometride, kalp yok ve ışık kaynağının yoğunluğu, dedektör doyurmak için ayarlı. (B) yan ateş kateter sol ventrikül içine yerleştirilir ve kalp gelen iletilen ışık toplanır ve gösterilir. Ekleme, 400, bu bölgeden ışık karmaşık iletim açığa 580 nm bölge genişletilmiş gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Şekil 2 : Spektral montaj için kullanılan kardiyak chromophores referans spektrumları. Spectra çeşitli yöntemlerle toplanan22 ve azaltılmış olan-oksitlenmiş (sitokrom için) ve deoxygenated – oksijenli (miyoglobin için). Ben0Için, Şekil 1A spektrum sadece referans yapmak için bir emici terim dönüştürülür. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Şekil 3 : Zaman Içinde akış ve optik değişiklikler. Her bir kroromophore optik yoğunluk değişimi (ΔOD) sadece maksimum emici olarak donatılmış bireysel kroromophore spektrumudur. Maksimum emici Frekanslar daha önce20,26olarak tanımlanmıştır. Sunulan zaman kursu bir deney için, bir temel gösteren, siyanür enjeksiyon (0,10 maksimum perfusat akışında mM), siyanür yıkma, nitrojen ile oksijen değiştirerek yapılan azot hipoksi ve sonra tam iskemi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Şekil 4 : Çeşitli koşulların monte fark spektrumları. (A) siyanür enjeksiyonu yelpazesini eksi temel. En az kare rutininden elde edilen uygun spektrum da çizilir. Kalıntı spektrum ham ve fit Spectra arasındaki farktır. (B) Şekil 4A’da sunulan uyum oluşturmak için kullanılan referans spektrumudur. Program, Şekil 2 ‘ deki referansları geçerli fark spektrumundaki göreli katkıya ölçekler. (C) aynı A, ancak siyanür enjeksiyonu karşı yıkın fark spektrumunu gösteren. (D) aynı A, ancak temel karşı iskemi fark spektrumunu gösteren. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Şekil 5 : Seçilen sitlosit, miyoglobin ve kardiyak akışlarda siyanür infüzyon etkisinin yüksek temporal çözünürlüğü. (A) kalp akımı, deoxymiyoglobin, azaltılmış sitokrom A605, ve azaltılmış sitokrom c. sayılar, Şekil 5B’de taban çizgisine göre alınan spektrumların konumuna bakın. (B) Şekil 5A VERSUS Control (pozisyon 1) etiketli 4 pozisyon için fark spektrumları. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Discussion

İzole retrograd veya çalışma perfel kalp preparasyon kardiyak Fizyoloji çalışmada bir ana yanı sıra tekniklerin ve kalp üzerindeki ilaçların preklinik soruşturma olduğunu. Kullanım anahtarı hazırlık kolaylığı, sağlam fonksiyonel özellikleri ve deneysel parametrelerin kontrolü yanı sıra dayak kalbin birçok fonksiyonel parametreleri ölçmek için yeteneği olmuştur. Optik emici spektroskopisi, doku oksijenasyonu ve mitokondri metabolik aktivitelerinin yanı sıra fikir sağlar. Optik spektroskopisi, hareket ve ışık saçılma komplikasyonlarından dolayı yorumlanması zor olan yansıtma modunda izole edilmiş perfellik kalp çalışmalarında öncelikle yürütülmüştür.

Biz ventrikül duvar iletim optik spektroskopisi tanıttı (VWTOS) kardiyak doku metabolik chromophores izleme sağlam bir yöntem sağlamak için. Bir önceki yayında, biz bir LED koaksiyel kablo ucunu kablolu gösterdi20 benzersiz bir intrakardiyak yan ateş ışık kaynağı vwtos perfüze kalpler için kullanılabilir hale getirir. Yan atış, ventrikül serbest duvarı aydınlatmak için ideal olan kateterin uzun eksenine dik ışık yansıtılması anlamına gelir. LED kateter kalp fonksiyonunu etkilebilecek kadar küçüktü ama laboratuvarda gerekli özel imalat. Mevcut çalışma, fiber optik ile uyumlu herhangi bir ışık kaynağına birleştirilebilir bir 500 mikron ticari yan ateş kateter kullanımını sunar. Bu yan ateş optik kateterler fiber uzun eksenine dik lazer ablasyon için ticari olarak geliştirilmiştir. Doğal olarak, fotoablasyon için gerekli olandan çok daha düşük ışık gücü kullanıyoruz. Daha küçük lifler perfüze fare kalp27gibi küçük preparatlar üzerinde kullanılabilir. Bu fiber optik sistem, kardiyak kroofozların absorbe edildiği dalga boyu aralığında kalp duvarından yeterli aydınlatma sağladı (450 – 630 nm). Kalp dışında bir Pickup fiber optik kullanarak, miyoglobin ve mitokondri sitokromların emici mükemmel temporal ve spektral çözünürlük ile izlenebilir (bkz. Şekil 5). Yan ateşleme fiber optik yaklaşım VWTOS için LED kateter üzerinde çeşitli avantajları vardır, kateterin kalp üzerinde etkisini en aza indirir çok daha küçük bir kesit profili de dahil olmak üzere, kardiyak Vana ve daha esnek azaltma etkisi ventrikül performansı, tuz perfusate dışarı kısa olabilir elektrik bağlantıları, ve son olarak VWTOS için ışık kaynağı seçimi esnekliğini artıran bir dış ışık kaynağı kullanan bir kateter.

490 nm altında kalbin güçlü emici nedeniyle, 410 – 445 nm veya NADH bölge 340 Nm ‘de sitneli Soret bandı hakkında çok bilgi üretmek zordur. Böylece, 450 nm de FAD geniş emici, bu chromophores tüm emme zirve örneklenmemiştir rağmen gözlenen en düşük frekans emici olduğunu. VWTOS kullanarak gürültü oranı sinyal çok yüksek tüm duvar yüzey yansıma spektroskopisi aksine örneklendiği gibi, yaygın olarak kullanılan20, sadece sayısız saçılma sorunları ile kalp yüzeyi örnekleri. VWTOS örnekleme tüm kalp duvarı daha benzer nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMRS) gibi birçok kardiyak metabolitleri önlemler 31P algılanan adenozin trifosfat ve kreatin fosfat28, 13C algılandı etiketli metabolitler29,30 hiperpolarize Etiketler dahil31,32, ve 1H algılanan metabolitler33. VWTOS manyetik olmayan cihazlar kullanılarak gerçekleştirilebilir gibi, NMR ve VWTOS aynı anda yapılabilir tamamen uygulanabilir. VWTOS endojen chromophores ile sınırlı değildir ve pH için Optik Problar emilimini izlemek için kullanılabilir, CA2 +, ve plazma membran potansiyeli.

Gürültü için mükemmel tek spektrum sinyali sağlayan 2 Hz (yani 2 numune/sn) kullanıyoruz. Kalp döngüsü analizine izin veren daha yüksek örnekleme hızları elde edilebilir olsa da, önceki çalışmalar kroromophore emici varyasyon yenmek için hiçbir Beat olduğunu göstermiştir, bu yüzden hiçbir çaba seçici kalp döngüsü bir işlev olarak ışık toplamak için 34yaptı. VWTOS geometrisi nedeniyle, ışık tespiti, karmaşık yüzey saçılma olayları ortadan kaldırılmadan sonra yansıma yöntemlerinden daha az doku hareketine bağlıdır. Biz bu ciddi hareket bu önlemleri bozabilir bulmak, ama gerçek zamanlı spektral analiz hızla spektral geçişler doku kroromophore geçişler ile tutarsız ortaya çıkarır. Yine, bu sadece kalp ciddi bir şekilde toplanan iletilen ışık miktarını azaltan toplama fiber uzak hareket ettiğinde oluşur.

Vwtos verileri, daha önce20,22,27olarak açıklandığı gibi, kardiyak chromophores Spectra ve ışık kaynağının spektrumunun bir referans kitaplığına dayalı tam spektral sığdırma rutin kullanılarak analiz edilir 35 basit bir doğrusal en az kareler yaklaşımı ile. Bu spektral montaj prosedürü, emici spektrumunun örtüşmesi için telafi edilir ve “isobestic” dalga boylarında güvenmez. Bu tam spektrum analizi, ortak Çift kiriş (Yani iki dalga boyu) analizi1,3,6 sorunlu olduğu gösterilmiştir ilişkili eserler ortadan kaldırır20. Tam spektral analizinin ek avantajı, Çift kiriş protokollerinde mevcut olmayan, resiflerden uygun bir iyilik üretmesi.

Bu çalışmada, siyanürün kalp optik özelliklerine etkisi üzerinde duruldu. Siyanür blokları sitokrom oksidaz olarak, bu oksijen tüketimini inhibe ve aslında sitokrom zincirinde geri elektronlar olarak tüm sitokorlerin net azaltma sonuçları. Ancak, membran potansiyeli Görünüşe göre yüksek kalır, bL ve bH ‘deki redoks değişiklikleri, sitokrom c13ile karşılaştırıldığında çok küçüktür. Oksijen tüketiminin durdurulması ile dokuda oksijen gerilimi Perfüzyona yaklaşmalıdır ve oksijenli miyoglobin içinde siyanür ile birlikte, retrograd perfüzyonunda bile, tuz perfüzyon kalp, kavramla tutarlı bir erken artış kaydetti modları, tam olarak sitominde miyoglobin oxygenating değildir19,20,21,36. Siyanürün oksijenli miyoglobin üzerindeki maksimum etkisini karşılaştırarak, iskemi ile elde edilen tamamen deoksigenated spektrumlu, sadece% 88 ‘ lik, önceki çalışmalarda tutarlı bir miyoglobin oksijenasyonu ortaya çıkarır.

Bu çalışmada, miyoglobin oksijenasyon ve sitokrom azaltma üzerindeki siyanür etkilerinin geçici olarak çözüldüğünü dikkate almak önemlidir. Siyanür etkilerinin ilk olarak koroner akışa ve miyoglobin üzerinde görülmeden önce, kalbin sitrosit redoks durumundaki büyük değişikliklere dikkat edilmesi şaşırtıcı bir durumdur. Akıştaki erken işaretli artış, kalp hücrelerinde brüt metabolik etkilerin görülmeden önce arteriyel pürüzsüz Kas24,37 üzerinde bir etkiye neden olabileceğini göstermektedir. Akımının artması, muhtemelen solunum sırasında mütevazı bir siyanür ile indüklenen azalma, oksijen tesliminde artışa neden olan oksijenli miyoglobin hemen artışla sonuçlanır. Miyoksitlere siyanür inhibisyonu yayılması ile, koroner akışta daha fazla artış görülür ( Şekil 5a‘da 3 olarak işaretlenmiş bölgeye bakın), muhtemelen38çok sayıda metabolik faktör tarafından tahrik. Siyanür akışında büyük erken etkisi vasküler pürüzsüz kas metabolizması miyoksit metabolizması daha vasküler tonu değiştirerek daha güçlü olabileceğini göstermektedir. Bu veriler, miyoglobin ‘in Cox ‘dan daha fazla oksijen için çok daha düşük bir yakınlık olduğunu, bozulmamış kalbinden bile, miyoglobin oksijenasyon mitokondri redoks durumundaki değişikliklerden önce de ortaya çıktığını destekler (Şekil 5). Bu yüksek düzeyde deoxygenated miyoglobin kontrol koşulları altında önceden yapılan çalışmalar ile tutarlı olduğunu düşündürmektedir izole tuzlu tuz bile kontrol koşulları altında kısmen hipoktik olabilir9,19, 20,21,27,36, kardiyak fizyolojide bu önemli modeli kullanırken kardiyak doku oksijenasyon izleme önemini vurgulayan.

Burada izole perfkullanılmış kalp iletim emilim spektroskopisi yürütmek için deneysel ayrıntıları sunuyoruz. Biz başarılı bir ince yan ateş intrakardiyak optik fiber kullanarak fare tavşan kalpleri kullanmak için bu tekniği adapte ettik. Sanat tam spektral sığdırma rutinleri kullanarak, kardiyak chromophores karmaşık optik etkileşim kolayca elde edilebilir, geleneksel ile aynı anda miyokard metabolizması kritik unsurların yakın gerçek zamanlı ölçmek fonksiyonel önlemler.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma tamamen NHLBı intramural programı (proje # ZıA HL00460131) tarafından destekleniyordu.

Materials

BIOPAC data acquisition system BIOPAC MP150 Analog to digitial conversion
BIOPAC general purpose transducer amplifiers BIOPAC DA100C Pressure monitoring
BIOPAC System skin temperature amplifier BIOPAC SKT100B temperature monitoring
Compact Universal 1- and 2- Channel LED Controllers Mightex SLC-MA02-U External light source power supply
Disposable pressure sensors BIOPAC RX104A Pressure monitoring
Dual Syringe, Infusion Pump KdScientific KDS 200 / 200P LEGACY SYRINGE PUMP drug injection
Flow-through probes Transonic 4PXN perusate flow monitoring
Glass Syringe FORTUNA Optima 30 CC Air tight fluid injection
High power fiber-coupled LED white light source Mightex Type-A FCS-0000 External light source
Perfused heart system Radnoti 120101BEZ This system was heavily modified to provide adequate flow (see manuscript)
Phase fluorimeter Ocean Optics NeoFox-GT oxygen concentration
Pickup fiber optic Thor labs BF20HSMA01 Fiber for collecting transmitted light (pick up fiber)
PowerLab unit AD Instruments PowerLab 8/35 Analog to digitial conversion
Pressure transducers BIOPAC TSD104A pressure monitoring
Programming environment LABViEW N/A Software for driving spectrometer, digitiziing data and analysis. Code available on request
Rapid scanning spectrophotometer Ocean Optics QE65PRO Rapid scanning spectrometer for spectral analysis
Side firing fiber optic Polymicro Technologies Molex, LLC 18019 North 25th Av, Phoenic AZ 85023-1200 JTFLH200230500/1.5M  side firing fiber optic 200 microns core 
Sodium cyanide Sigma-Aldrich 380970 Metabolic inhibitor
Temperature probe BIOPAC TSD102A temperature monitoring
Tubing flow modules Transonic TS410 perusate flow monitoring
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arai, A. E., Kasserra, C. E., Territo, P. R., Gandjbakhche, A. H., Balaban, R. S. Myocardial oxygenation in vivo: optical spectroscopy of cytoplasmic myoglobin and mitochondrial cytochromes. American Journal of Physiology. 277, 683-697 (1999).
  2. Epstein, F. H., Balaban, R. S., Ross, B. D. Redox state of cytochrome aa3 in isolated perfused rat kidney. American Journal of Physiology. 243 (4), 356-363 (1982).
  3. Hassinen, I. E., Hiltunen, J. K., Takala, T. E. S. Reflectance spectrophotometric monitoring of the isolated perfused heart as a method of measuring the oxidation-reduction state of cytochromes and oxygenation of myoglobin. Cardiovascular Research. 15, 86-91 (1981).
  4. Makino, N., Kanaide, H., Yoshimura, R., Nakamura, M. Myoglobin oxygenation remains constant during the cardiac cycle. American Journal of Physiology. 245 (14), 237-243 (1983).
  5. Takahashi, E., Doi, K. Visualization of oxygen level inside a single cardiac myocyte. American Journal of Physiology. 268, 2561-2568 (1995).
  6. Heineman, F. W., Kupriyanov, V. V., Marshall, R., Fralix, T. A., Balaban, R. S. Myocardial oxygenation in the isolated working rabbit heart as a function of work. American Journal of Physiology. 262, 255-267 (1992).
  7. Arakaki, L. S., Burns, D. H., Kushmerick, M. J. Accurate myoglobin oxygen saturation by optical spectroscopy measured in blood-perfused rat muscle. Applied Spectroscopy. 61 (9), 978-985 (2007).
  8. Bose, S., French, S., Evans, F. J., Joubert, F., Balaban, R. S. Metabolic network control of oxidative phosphorylation: multiple roles of inorganic phosphate. Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39155-39165 (2003).
  9. Tamura, M., Oshino, N., Chance, B., Silver, I. A. Optical measurements of intracellular oxygen concentrations of rat heart in vitro. Archives of Biochemistry and Biophysics. 191, 18-22 (1978).
  10. Wright, T. J., Davis, R. W. Myoglobin oxygen affinity in aquatic and terrestrial birds and mammals. The Journal of Experimental Biology. 218, 2180-2189 (2015).
  11. Wright, T. J., Davis, R. W. Myoglobin extraction from mammalian skeletal muscle and oxygen affinity determination under physiological conditions. Protein Expression and Purification. 107, 50-55 (2015).
  12. Shibata, T., et al. Relationship between oxygen affinity and autoxidation of myoglobin. Inorganic Chemistry. 51 (21), 11955-11960 (2012).
  13. Kim, N., Ripple, M. O., Springett, R. Measurement of the mitochondrial membrane potential and pH gradient from the redox poise of the hemes of the bc1 complex. Biophysical Journal. 102 (5), 1194-1203 (2012).
  14. Oshino, N., Jamieson, D., Sugano, T., Chance, B. Mitochondrial function under hypoxic conditions: The steady states of cytochrome a,a3 and their relation to mitochondrial energy states. Biochimica et Biophysica Acta. 368, 298-310 (1974).
  15. Glancy, B., Willis, W. T., Chess, D. J., Balaban, R. S. Effect of calcium on the oxidative phosphorylation cascade in skeletal muscle mitochondria. Biochemistry. 52 (16), 2793-2809 (2013).
  16. Figulla, H. R., Hoffmann, J., Lubbers, D. W. Evaluation of reflection spectra of the isolated heart by multicomponent spectra analysis in comparison to other evaluating methods. Advances in Experimental Medicine and Biology. 169, 821-830 (1984).
  17. Hoffmann, J., Lubbers, D. W., Heise, H. M. Applicability of the Kubelka-Munk theory for the evaluation of reflectance spectra demonstrated for haemoglobin-free perfused heart tissue. Physics in Medicine and Biology. 43 (12), 3571-3587 (1998).
  18. Fabel, H., Lubbers, D. W. Measurements of Reflection Spectra of Beating Rabbit Heart in Situ. Biochemische Zeitschrift. 341 (4), 351 (1965).
  19. Schenkman, K. A., Beard, D. A., Ciesielski, W. A., Feigl, E. O. Comparison of buffer and red blood cell perfusion of guinea pig heart oxygenation. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 285 (5), 1819-1825 (2003).
  20. Femnou, A. N., et al. Intracardiac light catheter for rapid scanning transmural absorbance spectroscopy of perfused myocardium: measurement of myoglobin oxygenation and mitochondria redox state. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 313 (6), 1199-1208 (2017).
  21. Kuzmiak-Glancy, S., et al. Cardiac performance is limited by oxygen delivery to the mitochondria in the crystalloid-perfused working heart. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 314 (4), 704-715 (2018).
  22. Chess, D. J., et al. Optical spectroscopy in turbid media using an integrating sphere: mitochondrial chromophore analysis during metabolic transitions. Analytical Biochemistry. 439 (2), 161-172 (2013).
  23. Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. Multiparametric optical mapping of the Langendorff-perfused rabbit heart. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
  24. Coburn, R. F., Grubb, B., Aronson, R. D. Effect of cyanide on oxygen tension-dependent mechanical tension in rabbit aorta. Circulation Research. 44 (3), 368-378 (1979).
  25. Schenkman, K. A., Marble, D. R., Burns, D. H., Feigl, E. O. Myoglobin oxygen dissociation by multiwavelength spectroscopy. Journal of Applied Physiology. 82 (1), 86-92 (1997).
  26. Femnou, A. N., et al. Intracardiac light catheter for rapid scanning transmural absorbance spectroscopy of perfused myocardium: measurement of myoglobin oxygenation and mitochondria redox state. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 313 (6), 1199-1208 (2017).
  27. Giles, A. V., et al. Paradoxical Arteriole Constriction Compromises Cytosolic and Mitochondrial Oxygen Delivery in the Isolated Saline-Perfused Heart. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory. , (2018).
  28. Matthews, P. M., et al. A 31P-NMR study of some metabolic and functional effects of the inotropic agents epinephrine and ouabain, and the ionophore R02- 2985 (X537A) in the isolated, perfused rat heart. Biochimica et Biophysica Acta. 720, 163-171 (1982).
  29. Lewandowski, E. D., Damico, L. A., White, L. T., Yu, X. Cardiac responses to induced lactate oxidation: NMR analysis of metabolic equilibria. American Journal of Physiology. 269, 160-168 (1995).
  30. Lewandowski, E. D., et al. Multiplet structure of 13C NMR signal from glutamate and direct detection of tricarboxylic acid (TCA) cycle intermediates. Magnetic Resonance in Medicine. 35 (2), 149-154 (1996).
  31. Ball, D. R., et al. Hyperpolarized butyrate: a metabolic probe of short chain fatty acid metabolism in the heart. Magnetic Resonance in Medicine. 71 (5), 1663-1669 (2014).
  32. Mariotti, E., et al. Modeling non-linear kinetics of hyperpolarized [1-(13)C] pyruvate in the crystalloid-perfused rat heart. NMR in Biomedicine. 29 (4), 377-386 (2016).
  33. Pisarenko, O. I., Khlopkov, V. N., Ruuge, E. K. A 1H NMR study of succinate synthesis from exogenous precursors in oxygen-deprived rat heart mitochondria. Biochemistry International. 12 (1), 145-153 (1986).
  34. Kuzmiak-Glancy, S., et al. Cardiac performance is limited by oxygen delivery to the mitochondria in the crystalloid-perfused working heart. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 314 (4), 704-715 (2018).
  35. Schenkman, K. A., Marble, D. R., Burns, D. H., Feigl, E. O. Myoglobin oxygen dissociation by multiwavelength spectroscopy. American Journal of Physiology. 82 (1), 86-92 (1997).
  36. Beard, D. A., Schenkman, K. A., Feigl, E. O. Myocardial oxygenation in isolated hearts predicted by an anatomically realistic microvascular transport model. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 285 (5), 1826-1836 (2003).
  37. Paul, R. J., Bohr, D. E., Somlyo, A. P., Sparks, H. V. Section II: The Cardiovascular System, Vol II, Vascular Smooth Muscle. Handbook of Physiology. , 201-252 (1980).
  38. Feigl, E. O. Coronary physiology. Physiological Reviews. 63, 1-205 (1983).

Tags

Intra-cardiacSide-firingLight CatheterTransmural Absorbance SpectroscopyPerfused Mammalian HeartsMitochondrial MetabolismMyocardial FunctionFiber Optic CatheterMitral ValveLeft Ventricular Free WallRapid Scanning SpectrometerRoom Light ContaminationData AcquisitionChromophore Reference Spectra

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Femnou, A. N., Giles, A., Balaban, R. S. Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts. J. Vis. Exp. (147), e58992, doi:10.3791/58992 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image