Здесь мы вводим метод использования внутрижелудочкового оптического катетера в потупоротивом сердце для выполнения спектроскопии абсорбции через стенку сердца. Полученные данные обеспечивают надежную информацию о напряжении кислорода тканей, а также о использовании субстрата и мембранном потенциале одновременно с показателями сердечной деятельности в этой вездесущей подготовке.
Абсорбционная спектроскопия сердечной мышцы обеспечивает неразрушительную оценку цитосолиальной и митохондриальной оксигенации с помощью миоглобина и цитохромной абсорбции соответственно. Кроме того, можно оценить многочисленные аспекты митохондриального метаболического статуса, такие как мембранный потенциал и вход подроттрата. Для выполнения оптической спектроскопии передачи сердечной стены, коммерчески доступные боковой стрельбы оптического волокна катетер помещается в левый желудочек изолированного проникнутого сердца в качестве источника света. Свет, проходящий через стенку сердца, собирается с помощью внешнего оптического волокна для выполнения оптической спектроскопии сердца практически в режиме реального времени. Подход к передаче позволяет избежать многочисленных помех рассеяния поверхностей, возникающих при широко используемых подходах к отражению. Изменения в спектре трансмурфальной абсорбции были deconvolved с помощью библиотеки хромофора справочных спектров, обеспечивая количественные показатели всех известных сердечных хромофор одновременно. Этот спектральный подход к деконволюции устраняет внутренние ошибки, которые могут возникнуть в результате использования общих методов двойной длины волны, применяемых к перекрывающимся спектрам абсорбции, а также обеспечивает количественную оценку доброты подгонки. Для сбора и анализа данных была разработана пользовательская программа, которая позволила следователю следить за метаболическим состоянием препарата во время эксперимента. Эти относительно простые дополнения к стандартной системе перфузии сердца обеспечивают уникальное понимание метаболического состояния стенки сердца в дополнение к обычным мерам сокращения, перфузии и субстрата/ кислородной экстракции.
Оптическая абсорбционная спектроскопия для мониторинга нетронутой биохимии органов являетсяшироко используемым подходом из-за его внутренней, неразрушающей природы 1,2,3,4, 6,7,8,9. Абсорбция миоглобина обеспечивает измерение среднего цитосолильного кислородного напряжения10,11,12. Митохондриальные цитохромы предоставляют информацию о вводе субстрата на уровне флавинов, мембранного потенциала от цитохрома bL:bH13,а также доставки кислорода в митохондрии в клетку из цитохрома оксидазы (COX ) состояние редокса14. Glancy et al. продемонстрировали, что деятельность каждого комплекса может быть определена путем измерения потенциала митохондриальной мембраны и скорости обменавеществ 15. Таким образом, с помощью оптической спектроскопии, огромное количество информации может быть получено без необходимости экзогенных зондов или крупных модификаций существующих систем исследования. Целью данной работы является представление надежного метода сбора оптических спектров передачи в обычных проникнутых сердечных препаратов с единственной крупной модификацией, выполняющей исследования в затемненной среде.
Спектроскопия поглощения отражения успешно используется для выполнения оптической спектроскопии пронзаемного сердца3,6,16,17,18,19 как сердце in vivo1. Спектроскопия отражения состоит из посягающего света на поверхность сердца и сбора света, рассеянного через сердце, а также рассеянного и зеркального отраженного света. Таким образом, собранный свет в этом подходе представляет собой состав нескольких механизмов рассеяния, а также ткани хромофора абсорбции интерес. Из-за движения и сложной поверхности сердца, отражение света от поверхности сердца особенно проблематично, изменяя глубину проникновения и количество чисто отраженного света.
Ограничения отражения поглощения спектроскопии, представленные выше, были решены путем введения оптического катетера в полость левого желудочка, что позволяет сбор передаваемого света через левый желудочек свободной стены20. Преимущества спектроскопии передачи для этого типа исследования были оценены в ранних инвазивных исследованиях Tamura et al.9 Текущая реализация обеспечивает очень надежный анализ спектроскопии передачи нетронутого сердца с относится к цитосоликической оксигенации и митохондрии редокс состояние при различных условиях21. Эти первоначальные исследования использовали специально изготовленный катетер с питанием светодиод на кончике ориентированных на создание боковой стрельбы картины белого света через миокард. Тем не менее, относительно большой светодиодный катетер наконечником подходит только для использования на сердцах среднего размера (кролик, морская свинка и т.д.) и требуется пользовательских изготовления. В текущем исследовании представлен метод использования коммерчески доступного 200-микроня бокового обжигаемого оптического волокна в качестве светового направляющего. Вместо проводного светодиода на кончике катетер с наконечником 500 микроперенаправляет свет от внешнего источника, увеличивая универсальность системы. Такой подход позволяет использовать широкий спектр внешних источников света, включая лазеры для таких приложений, как Раман рассеяния спектроскопии. Для количественной оценки этих данных, онлайн полный многокомпонентный спектральный анализ с использованием известных спектральных спектров для повышения точности спектроскопического определения сердечных хромофор представлен как ранее описано20,22. Исходный код для этого анализа будет предоставлен авторами по запросу. Используя этот подход, информация о сердечной биохимии и митохондриальной функции может быть получена одновременно с обычными сердечными функциональными параметрами практически без влияния на сердечную подготовку. Поскольку сердце критически зависит от митохондриальной функции и доставки кислорода, это техническое дополнение к классической проникнутой сердечной системы значительно улучшит интерпретацию и полезность этой важной модели сердечной деятельности.
Изолированный ретроградный или рабочий проникнутый сердечный препарат является основой в изучении сердечной физиологии, а также доклиническое исследование методов и препаратов на сердце. Ключом к его использованию стала простота подготовки, надежные функциональные характеристики и контроль экспериментальных параметров, а также способность измерять многие функциональные параметры бьющегося сердца. Оптическая абсорбция спектроскопии обеспечивает понимание оксигенации тканей, а также митохондрий метаболической деятельности. Оптическая спектроскопия в основном проводится в изолированных проникнуты исследования сердца в режиме отражения, что трудно интерпретировать из-за движения и свет рассеяния осложнений.
Мы внедрили оптическую спектроскопию на стенки желудочка (VWTOS), чтобы обеспечить надежный метод мониторинга сердечной ткани метаболических хромофоров. В предыдущей публикации, мы продемонстрировали, что светодиодные проводной к кончику коаксиального кабеля20 делает уникальный внутрисердечный боковой стрельбы источник света, который может быть использован для VWTOS проникнуты сердца. Боковая стрельба относится к проекции света перпендикулярно длинной оси катетера, идеально подходит для освещения стенки желудочка. Светодиодный катетер был достаточно мал, чтобы не влиять на сердечную функцию, но требовал специализированного изготовления в лаборатории. Текущее исследование представляет собой использование 500 микрон коммерческих боковой стрельбы катетер, который может быть связан с любым источником света совместимы с волоконной оптикой. Эти боковые оптические катетеры были коммерчески разработаны для лазерной абляции перпендикулярно длинной оси волокна. Естественно, мы используем световую энергию гораздо ниже, чем требуется для фотоаблирования. Меньшие волокна доступны для использования на небольших препаратов, таких как пронзительный сердце мыши27. Эта волоконно-оптическая система обеспечивает адекватное освещение через стенку сердца в диапазоне длин волн, где сердце хромофоры поглощают (450-630 нм). Использование пикап волокна оптики на внешней стороне сердца, поглощение миоглобина и митохондрий цитохромы могут контролироваться с отличным височным и спектральным разрешением (см. Рисунок 5). Боковой огнем волоконно-оптический подход имеет несколько преимуществ по сравнению с светодиодным катетером для VWTOS, в том числе гораздо меньше поперечного сечения профиля катетера, что сводит к минимуму воздействие катетера на сердце, более гибкое снижение воздействия на сердечный клапан и производительность желудочка, нет электрических соединений, которые могут короткие в солей perfusate, и, наконец, катетер, который использует внешний источник света, что увеличивает гибкость выбора источника света для VWTOS.
Из-за сильного поглощения сердца ниже 490 нм, трудно генерировать много информации о soret полосе цитохромов в области 410-445 нм или NADH на 340 нм. Таким образом, широкое поглощение FAD на 450 нм является самой низкой частотой абсорбции, которая наблюдается, хотя весь пик поглощения этого хромофора не пробы. Использование VWTOS соотношение сигнала к шуму очень высока, как вся стена пробы в отличие от спектроскопии отражения поверхности, обычно используется20, который только образцы поверхности сердца с многочисленными проблемами рассеяния. VWTOS выборки всей стенки сердца является более аналогом ядерной магнитно-резонансной спектроскопии (NMRS) меры многих сердечных метаболитов, таких как 31P обнаруженный аденозин трифосфат и креатин фосфат28, 13C обнаружены помечены метаболитов29,30 в том числе гиперполяризованных этикетки31,32,и 1H обнаруженных метаболитов33. Поскольку VWTOS может проводиться с использованием немагнитных устройств, вполне возможно, что НМР и VWTOS могут проводиться одновременно. VWTOS не ограничивается эндогенными хромофорами и может быть использован для мониторинга поглощения оптических зондов для рН, Ca2“, и плазменной мембраны потенциал.
Мы используем 2 Гц (т.е. 2 образца/сек), который обеспечивает отличный сигнал одного спектра к шуму. Хотя более высокие показатели выборки могут быть достигнуты, что позволяют анализ сердечного цикла, предыдущие исследования показали, что нет бить изменения в абсорбции хромофора, так что никаких усилий, чтобы выборочно собирать свет, как функция сердечного цикла было сделал34. Из-за геометрии VWTOS, обнаружение света менее зависит от движения ткани, чем методы отражения, так как сложные события рассеяния поверхности устраняются. Мы находим, что тяжелое движение может нарушить эти меры, но спектральный анализ в реальном времени быстро выявляет спектральные переходы, несовместимые с переходами хромофора тканей. Опять же, это происходит только тогда, когда сердце движется грубо от сбора волокна резко уменьшая количество собранного передаваемого света.
Данные VWTOS анализируются с использованием полной спектральной установки на основе справочной библиотеки спектров сердечных хромофоров и спектра источника света, как ранее описано20,22,27, 35 с простым линейным подходом наименьших квадратов. Эта процедура спектральной установки компенсировала перекрывающийся спектр абсорбции и не полагается на “изобестические” длины волн. Этот полный анализ спектра устраняет артефакты, связанные собщим двойным лучом (т.е. двухдиапазонным) анализом 1,3,6, который, как было показано, является проблематичным20. Дополнительным преимуществом полного спектрального анализа является генерация добра подгонки из остатков, недоступных в протоколах двойного луча.
В этом исследовании мы сосредоточились на влиянии цианида на оптические свойства сердца. Поскольку цианид блокирует цитохромоксидазы, он подавляет потребление кислорода и по существу приводит к чистому сокращению всех цитохромов, как электроны резервного копирования в цепочке цитохром. Тем не менее, мембранный потенциал, по-видимому, остается высоким, так как изменения редокса в bL и bH очень малы по сравнению с цитохромомc 13. С прекращением потребления кислорода, кислородное напряжение в ткани должны приближаться к перфузату, и мы отметили раннее увеличение кислорода миоглобина с цианидом в соответствии с понятием, что солин проникнуты сердца, даже в ретроградной перфузии режимы, не полностью оксигенации миоглобина в цитозол19,20,21,36. Сравнение максимального воздействия цианида на насыщенный кислородом миоглобин с полностью дезоксигенированным спектром, полученным при ишемии, показывает оксигенацию миоглобина всего около 88%, что соответствует предыдущим исследованиям.
Важно отметить, в этом исследовании, что цианид воздействия на оксигенацию миоглобина и цитохром сокращения были временно решены. Удивительно, что эффекты цианида впервые наблюдались на коронарном потоке и миоглобине до того, как наблюдались значительные изменения в состоянии цитохрома редокса сердца. Раннее заметное увеличение потока свидетельствует о том, что влияние на артериальные гладкие мышцы24,37 может произойти до валового метаболического воздействия в клетках сердца наблюдается. Увеличение потока, потенциально при скромном цианид индуцированном снижении дыхания, вероятно, приводит к немедленному увеличению оксигенированного миоглобина, вызванного увеличением доставки кислорода. С распространением ингибирования цианида к миоцитам наблюдается дальнейшее увеличение коронарного потока (см. регион, отмеченный 3 на рисунке 5а),вероятно, обусловлен многочисленными метаболическими факторами38. Большое раннее воздействие цианида на поток свидетельствует о том, что метаболизм сосудистой гладкой мышцы может быть более мощным в изменении сосудистого тонуса, чем метаболизм миоцитов. Эти данные поддерживают устоявую идею о том, что миоглобин имеет гораздо более низкое сродство к кислороду, чем COX, даже в нетронутом сердце, как оксигенация миоглобина произошло задолго до изменения в состоянии редокс митохондрии(Рисунок 5). Этот высокий уровень дезоксигенированного миоглобина в условиях контроля согласуется с предыдущими исследованиями, предполагающими, что изолированный солен овое сердце может быть частично гипоксическим даже при контрольных условиях9,19, 20,21,27,36, подчеркивая важность мониторинга оксигенации сердечной ткани при использовании этой важной модели в сердечной физиологии.
Мы представляем здесь экспериментальные детали для проведения спектроскопии поглощения передачи на изолированном проникнутом сердце. Мы успешно адаптировали эту технику для использования на сердцах от кролика до мыши с помощью тонкого бокового обжига внутрисердечного оптического волокна. Используя состояние искусства полной спектральной установки процедур, сложное оптическое взаимодействие сердечных хромофоров могут быть легко извлечены обеспечивая, почти в режиме реального времени мера критических элементов метаболизма миокарда одновременно с обычными функциональных мер.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была полностью поддержана интрамуральной программой NHLBI (Проект ЗЗА HL00460131).
BIOPAC data acquisition system | BIOPAC | MP150 | Analog to digitial conversion |
BIOPAC general purpose transducer amplifiers | BIOPAC | DA100C | Pressure monitoring |
BIOPAC System skin temperature amplifier | BIOPAC | SKT100B | temperature monitoring |
Compact Universal 1- and 2- Channel LED Controllers | Mightex | SLC-MA02-U | External light source power supply |
Disposable pressure sensors | BIOPAC | RX104A | Pressure monitoring |
Dual Syringe, Infusion Pump | KdScientific | KDS 200 / 200P LEGACY SYRINGE PUMP | drug injection |
Flow-through probes | Transonic | 4PXN | perusate flow monitoring |
Glass Syringe | FORTUNA Optima | 30 CC | Air tight fluid injection |
High power fiber-coupled LED white light source | Mightex | Type-A FCS-0000 | External light source |
Perfused heart system | Radnoti | 120101BEZ | This system was heavily modified to provide adequate flow (see manuscript) |
Phase fluorimeter | Ocean Optics | NeoFox-GT | oxygen concentration |
Pickup fiber optic | Thor labs | BF20HSMA01 | Fiber for collecting transmitted light (pick up fiber) |
PowerLab unit | AD Instruments | PowerLab 8/35 | Analog to digitial conversion |
Pressure transducers | BIOPAC | TSD104A | pressure monitoring |
Programming environment | LABViEW | N/A | Software for driving spectrometer, digitiziing data and analysis. Code available on request |
Rapid scanning spectrophotometer | Ocean Optics | QE65PRO | Rapid scanning spectrometer for spectral analysis |
Side firing fiber optic | Polymicro Technologies Molex, LLC 18019 North 25th Av, Phoenic AZ 85023-1200 | JTFLH200230500/1.5M | side firing fiber optic 200 microns core |
Sodium cyanide | Sigma-Aldrich | 380970 | Metabolic inhibitor |
Temperature probe | BIOPAC | TSD102A | temperature monitoring |
Tubing flow modules | Transonic | TS410 | perusate flow monitoring |