In Vitro Differenzierung Modell der normalen Gedächtnis B Zellen zu langlebigen Plasmazellen
Summary
Mit mehrstufigen Kultur-Systeme, berichten wir eine in-vitro-B-Zelle zur Plasmazelle Differenzierung Modell.
Abstract
Plasmazellen (PCs) absondern, große Mengen von Antikörpern und entwickeln von B-Zellen, die aktiviert wurden. PCs sind seltene Zellen im Knochenmark oder in der Schleimhaut und humorale Immunität zu gewährleisten. Aufgrund ihrer niedrigen Frequenz und Position, die Untersuchung von PCs ist schwierig in der menschlichen. Wir berichteten einen B an PC in-vitro-Differenzierung Modell mit ausgewählten Kombinationen von Zytokinen und Aktivierung Moleküle, die es ermöglichen, um die sequentielle Zelldifferenzierung Auftritt in vivo zu reproduzieren. In diesem in-vitro-Modell, Speicher, B-Zellen (MBCs) in Pre-Plasmablasts (PrePBs), Plasmablasts (PBs), früh PCs unterscheiden werden und schließlich in langlebigen schließen-PCs mit einem Phänotyp zu ihren Gegenstücken in den gesunden Einzelpersonen. Wir bauten auch eine open-Access-Bioinformatik Werkzeuge um die prominentesten Informationen von GEP-Daten im Zusammenhang mit PC-Differenzierung zu analysieren. Diese Ressourcen können verwendet werden, um menschliche B PC Differenzierung und in der aktuellen Studie zu studieren, untersuchten wir Ausdruck Genregulation epigenetische Faktoren während der menschlichen B PC Differenzierung.
Introduction
Die Differenzierung der B-Zellen zu Plasmazellen (PCs) ist wichtig für die humorale Immunität und schützen die Gastgeber gegen Infektionen1. B PC Differenzierung ist verbunden mit großen Veränderungen in Transkription Kapazität und des Stoffwechsels, zu Antikörper-Sekretion unterzubringen. Die Transkriptionsfaktoren, die B auf PC Differenzierung Steuern wurden ausgiebig untersucht und offenbarten exklusive Netzwerke einschließlich B – und PC-spezifische Transkription Faktoren (TFs)2. In B-Zellen sind PAX5, BCL6 und BACH2 TFs die Hüter der B-Zell-Identität-2,–3. Induktion von IRF4, PRDM1 BLIMP1 und XBP1 PC TF-Codierung wird B-Zell-Gene zu löschen und induzieren eine koordinierte Antikörper-sezernierenden Zelle transkriptionelle Programm3,4,5. Diese koordinierte transcriptional Änderungen sind verbunden mit Ig Gene Transcription Aktivierung zusammen mit einem Wechsel von der Membran-gebundener Form zu sekretierte Form von Immunglobulin schwere Kette2,3, 4. B zu PC Differenzierung ist mit Induktion von Genen, die im endoplasmatischen Retikulum und Golgi-Apparat funktioniert mit unfolded Protein Response (UPR) Aktivierung bekannt, eine wichtige Rolle im PC zu spielen, durch die Aufnahme der Synthesis von abgesondert, Immunglobuline6,7. Die TF-XBP1 spielt eine wichtige Rolle in diesem zellulären Anpassung8,9,10.
B-Zellen und PCs sind Hauptakteure der humoralen Immunität. Verständnis der biologisches Prozesse, Kontrolle der Produktion und das Überleben der normalen Plasmazellen ist von entscheidender Bedeutung im therapeutischen Interventionen, die müssen effiziente Immunantworten zu gewährleisten und verhindern Autoimmunität oder Immunschwäche. PC sind seltene Zellen mit Frühstadium Differenzierung findet in anatomischen Standorten, die volle biologische Charakterisierung, besonders beim Menschen behindern. Mit mehrstufigen Kultur-Systemen, haben wir einen in-vitro-B PC Differenzierung Modell berichtet. Dieses Modell bildet die sequentielle Zell-Differenzierung und Reifung, die in den verschiedenen Organen in Vivo11,12,13. In einem ersten Schritt B Speicherzellen sind zunächst vier Tage lang durch CD40-Liganden, Oligodeoxynukleotiden und Zytokin-Kombination aktiviert und in Preplasmablasts (PrePBs) zu unterscheiden. In einem zweiten Schritt werden Preplasmablasts induziert, in Plasmablasts (PBs) zu unterscheiden durch CD40L und Oligodeoxynukleotiden Stimulation entfernen und ändern die Zytokin-Kombination. In einem dritten Schritt werden Plasmablasts induziert, in frühen PCs zu unterscheiden, indem Sie ändern die Cytokine Kombination11,12. Ein vierter Schritt wurde eingeführt, um ausgereifte PCs bekommen durch die Kultivierung dieser frühen PCs mit dem Knochenmark Stromazellen Zellen bedingt Medium oder Wachstumsfaktoren13ausgewählt. Diese ältere PCs in-vitro-mehrere Monate überleben und absondern, hohe Mengen an Immunglobulin (Abbildung 1). Interessanterweise, rekapituliert unsere in-vitro-Modell die koordinierte transcriptional Änderungen und dem Phänotyp der verschiedenen B PC-Stufen, die erkannten in-vivo-11,12,13,14 ,15. PCs sind seltene Zellen und unsere in-vitro-Differenzierung Modell erlaubt, um menschliche B PC Differenzierung zu studieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
In der Human-PC sind seltene Zellen mit Differenzierung Stufen statt an anatomischen stellen, die volle biologische Charakterisierung zu behindern. Haben wir einen in-vitro-B mit PC Differenzierung Modell mehrstufige Systeme wo sind verschiedene Kombinationen von Aktivierung Moleküle und Zytokine anschließend angewendet, um die sequenzielle Zelldifferenzierung im reproduzieren der verschiedene Organe/Gewebe in Vivo11,12,13.</p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von INCA Französisch (Institut National du Cancer) Institut (PLBIO15-256), ANR (Tie-Skip) und ITMO Krebs (MM & TT).
Materials
| anti-CD2 magnetic beads | Invitrogen | 11159D | |
| Anti-CD138-APC | Beckman-Coulter | B49219 | |
| Anti-CD19-APC | BD | 555415 | |
| Anti-CD20-PB | Beckman-Coulter | B49208 | |
| Anti-CD27-PE | BD | 555441 | |
| Anti-CD38-PE | Beckman-Coulter | A07779 | |
| Anti-histidine | R&D Systems | MAB050 | |
| CpG ODN(PT) | Sigma | T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C* G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T |
|
| human Transferin | Sigma-Aldrich | T3309 | |
| IFN-α | Merck | Intron A | |
| IMDM | Gibco | 31980-022 | |
| Recombinan Human CD40L-hi | R&D Systems | 2706-CL | |
| Recombinant Human APRIL | R&D Systems | 5860-AP-010 | |
| Recombinant Human IL-10 | R&D Systems | 217-IL- | |
| Recombinant Human IL-15 | Peprotech | 200-15-10ug | |
| Recombinant Human IL-2 Protein | R&D Systems | 202-IL- | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 |
References
- Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15 (3), 160-171 (2015).
- Shaffer, A. L., et al. Blimp-1 orchestrates plasma cell differentiation by extinguishing the mature B cell gene expression program. Immunity. 17 (1), 51-62 (2002).
- Minnich, M., et al. Multifunctional role of the transcription factor Blimp-1 in coordinating plasma cell differentiation. Nature Immunology. 17 (3), 331-343 (2016).
- Klein, U., et al. Transcription factor IRF4 controls plasma cell differentiation and class-switch recombination. Nature Immunology. 7 (7), 773-782 (2006).
- Gass, J. N., Gunn, K. E., Sriburi, R., Brewer, J. W. Stressed-out B cells? Plasma-cell differentiation and the unfolded protein response. Trends in Immunology. 25 (1), 17-24 (2004).
- Goldfinger, M., Shmuel, M., Benhamron, S., Tirosh, B. Protein synthesis in plasma cells is regulated by crosstalk between endoplasmic reticulum stress and mTOR signaling. European Journal of Immunology. 41 (2), 491-502 (2011).
- Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
- Shaffer, A. L., et al. XBP1, downstream of Blimp-1, expands the secretory apparatus and other organelles, and increases protein synthesis in plasma cell differentiation. Immunity. 21 (1), 81-93 (2004).
- Reimold, A. M., et al. Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1. Nature. 412 (6844), 300-307 (2001).
- Jourdan, M., et al. Characterization of a transitional preplasmablast population in the process of human B cell to plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 187 (8), 3931-3941 (2011).
- Jourdan, M., et al. An in vitro model of differentiation of memory B cells into plasmablasts and plasma cells including detailed phenotypic and molecular characterization. Blood. 114 (25), 5173-5181 (2009).
- Jourdan, M., et al. IL-6 supports the generation of human long-lived plasma cells in combination with either APRIL or stromal cell-soluble factors. Leukemia. , (2014).
- Kassambara, A., et al. Global miRNA expression analysis identifies novel key regulators of plasma cell differentiation and malignant plasma cell. Nucleic Acids Research. 45 (10), 5639-5652 (2017).
- Kassambara, A., et al. GenomicScape: an easy-to-use web tool for gene expression data analysis. Application to investigate the molecular events in the differentiation of B cells into plasma cells. PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004077 (2015).
- Miremadi, A., Oestergaard, M. Z., Pharoah, P. D., Caldas, C. Cancer genetics of epigenetic genes. Human Molecular Genetics. 16, 28-49 (2007).
- Pei, H., et al. The histone methyltransferase MMSET regulates class switch recombination. Journal of Immunology. 190 (2), 756-763 (2013).
- Le Gallou, S., et al. IL-2 requirement for human plasma cell generation: coupling differentiation and proliferation by enhancing MAPK-ERK signaling. Journal of Immunology. 189 (1), 161-173 (2012).
- Cocco, M., et al. In vitro generation of long-lived human plasma cells. Journal of Immunology. 189 (12), 5773-5785 (2012).
- Leung-Hagesteijn, C., et al. Xbp1s-negative tumor B cells and pre-plasmablasts mediate therapeutic proteasome inhibitor resistance in multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 289-304 (2013).
- Orlowski, R. Z. Why proteasome inhibitors cannot ERADicate multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 275-277 (2013).
- Ding, B. B., Bi, E., Chen, H., Yu, J. J., Ye, B. H. IL-21 and CD40L synergistically promote plasma cell differentiation through upregulation of Blimp-1 in human B cells. Journal of Immunology. 190 (4), 1827-1836 (2013).
- Tsai, C. M., et al. Galectin-1 promotes immunoglobulin production during plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 181 (7), 4570-4579 (2008).
- Tsai, C. M., et al. Galectin-1 and galectin-8 have redundant roles in promoting plasma cell formation. Journal of Immunology. 187 (4), 1643-1652 (2011).
- Anginot, A., Espeli, M., Chasson, L., Mancini, S. J., Schiff, C. Galectin 1 modulates plasma cell homeostasis and regulates the humoral immune response. Journal of Immunology. 190 (11), 5526-5533 (2013).
- Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. Journal of Immunology. 188 (3), 1283-1291 (2012).
- Belnoue, E., et al. APRIL is critical for plasmablast survival in the bone marrow and poorly expressed by early-life bone marrow stromal cells. Blood. 111 (5), 2755-2764 (2008).
- Huard, B., et al. APRIL secreted by neutrophils binds to heparan sulfate proteoglycans to create plasma cell niches in human mucosa. Journal of Clinical Investigation. 118 (8), 2887-2895 (2008).
- Ame-Thomas, P., et al. Human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and lymphoid organs support tumor B-cell growth: role of stromal cells in follicular lymphoma pathogenesis. Blood. 109 (2), 693-702 (2007).
- Ramachandrareddy, H., et al. BCL6 promoter interacts with far upstream sequences with greatly enhanced activating histone modifications in germinal center B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (26), 11930-11935 (2010).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends in Immunology. 34 (9), 460-470 (2013).
- Miles, R. R., Crockett, D. K., Lim, M. S., Elenitoba-Johnson, K. S. Analysis of BCL6-interacting proteins by tandem mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. 4 (12), 1898-1909 (2005).
- McManus, S., et al. The transcription factor Pax5 regulates its target genes by recruiting chromatin-modifying proteins in committed B cells. The EMBO Journal. 30 (12), 2388-2404 (2011).
- Ahmadnejad, M., et al. Elevated expression of DNMT1 is associated with increased expansion and proliferation of hematopoietic stem cells co-cultured with human MSCs. Blood Research. 52 (1), 25-30 (2017).
- Beguelin, W., et al. EZH2 is required for germinal center formation and somatic EZH2 mutations promote lymphoid transformation. Cancer Cell. 23 (5), 677-692 (2013).
- Herviou, L., Cavalli, G., Cartron, G., Klein, B., Moreaux, J. EZH2 in normal hematopoiesis and hematological malignancies. Oncotarget. 7 (3), 2284-2296 (2016).
- Beguelin, W., et al. EZH2 enables germinal centre formation through epigenetic silencing of CDKN1A and an Rb-E2F1 feedback loop. Nature Communications. 8 (1), 877 (2017).
- Herviou, L., et al. PRC2 targeting is a therapeutic strategy for EZ score defined high-risk multiple myeloma patients and overcome resistance to IMiDs. Clinical Epigenetics. 10 (1), 121 (2018).
- Asangani, I. A., et al. Characterization of the EZH2-MMSET histone methyltransferase regulatory axis in cancer. Molecular Cell. 49 (1), 80-93 (2013).
- Pei, H., et al. MMSET regulates histone H4K20 methylation and 53BP1 accumulation at DNA damage sites. Nature. 470 (7332), 124-128 (2011).
- Cui, J., et al. EHMT2 inhibitor BIX-01294 induces apoptosis through PMAIP1-USP9X-MCL1 axis in human bladder cancer cells. Cancer Cell International. 15 (1), 4 (2015).
- Santo, L., et al. Preclinical activity, pharmacodynamic, and pharmacokinetic properties of a selective HDAC6 inhibitor, ACY-1215, in combination with bortezomib in multiple myeloma. Blood. 119 (11), 2579-2589 (2012).
- Amengual, J. E., et al. Dual Targeting of Protein Degradation Pathways with the Selective HDAC6 Inhibitor ACY-1215 and Bortezomib Is Synergistic in Lymphoma. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4663-4675 (2015).
- Schoenhals, M., et al. Forced KLF4 expression increases the generation of mature plasma cells and uncovers a network linked with plasma cell stage. Cell Cycle. 15 (14), 1919-1928 (2016).
