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Immunology and Infection

En Vitro modelo de diferenciación de células de memoria humana Normal B a células plasmáticas duradero

Published: January 20, 2019
doi:
10.3791/58929
, , , ,
1IGH, CNRS,Univ Montpellier, 2Laboratory for Monitoring Innovative Therapies, Department of Biological Hematology,CHU Montpellier, 3UFR de Médecine,Univ Montpellier

Summary

Utilizando sistemas de cultivo de múltiples pasos, Divulgamos un in vitro células B al modelo de diferenciación de la célula de plasma.

Abstract

Células plasmáticas (PC) secretan grandes cantidades de anticuerpos y desarrollo de las células B que han sido activadas. PC es células en la médula ósea o la mucosa y garantizar la inmunidad humoral. Debido a su baja frecuencia y localización, es difícil el estudio de PC en humanos. Hemos informado a B para PC modelo de diferenciación in vitro usando las combinaciones de citoquinas y activación de moléculas que permiten reproducir la diferenciación secuencial que ocurre in vivo. En este modelo in vitro, memoria (MBCs) de células B diferencian en los plasmablasts (prePBs), plasmablasts PC (PBs), temprano y por último, en larga vida PC, con un fenotipo cerca de sus contrapartes en individuos sanos. También hemos construido un acceso abierto bioinformática herramientas para analizar la información más prominente de datos GEP de diferenciación de la PC. Estos recursos pueden utilizarse para estudiar humano B diferenciación de PC y en el presente estudio, hemos investigado la regulación de la expresión génica de factores epigenéticos durante humano B para diferenciación de PC.

Introduction

La diferenciación de células B a células plasmáticas (PC) es esencial para la inmunidad humoral y proteger al huésped contra infecciones1. B para diferenciación de PC se asocia con cambios importantes en el metabolismo y capacidad de transcripción para la secreción de anticuerpos. Se han estudiado ampliamente los factores de transcripción que controlan B para diferenciación de PC y redes exclusiva reveladas incluyendo transcripción B-PC-específicas y factores (TFs)2. En las células de B, PAX5, BCL6 y BACH2 TFs son los guardianes de la identidad de la célula de B2,3. Inducción de IRF4, PRDM1 codificación BLIMP1 y XBP1 PC TF se apaga genes de la célula B e inducir un coordinado secretoras de anticuerpo células programa transcripcional3,4,5. Estos cambios transcripcionales coordinados están asociados con la activación de transcripción de genes de Ig junto con un interruptor de la forma unida a la membrana a la forma secretada de la inmunoglobulina cadena pesada2,3, 4. B para diferenciación de PC está vinculada con la inducción de genes implicados en el retículo endoplásmico y aparato de Golgi funciones concomitantes con la activación de la respuesta (UPR) de proteína desdoblada conocida por desempeñar un papel clave en la PC con capacidad para la síntesis de secretan las inmunoglobulinas6,7. El TF XBP1 desempeña un papel importante en esta adaptación celular8,9,10.

Las células de B y PC es actores clave de la inmunidad humoral. Comprensión de lo biológico los procesos que controlan la producción y la supervivencia de las células de plasma normales es fundamental en las intervenciones terapéuticas que necesitan para garantizar la eficiente respuesta inmune y prevenir la autoinmunidad o inmunodeficiencia. PC son las células raras a etapas tempranas de la diferenciación tiene lugar en localizaciones anatómicas que dificultan la caracterización biológica completo, particularmente en humanos. Utilizando sistemas de cultivo de varios pasos, hemos divulgado una B in vitro al modelo de diferenciación de PC. Este modelo reproduce la diferenciación secuencial y la maduración que ocurre en los diferentes órganos en vivo11,12,13. En un primer paso, las células de memoria B se activan en primer lugar durante cuatro días por combinación de CD40 ligando, oligodeoxynucleotides y citocinas y se diferencian en preplasmablasts (PrePBs). En un segundo paso, preplasmablasts son inducidas a diferenciarse en plasmablasts (PBs) quitando CD40L y oligodeoxynucleotides estimulación y cambia la combinación de citocinas. En un tercer paso, plasmablasts son inducidas a diferenciar en las primeras PC cambiando la combinación de citocinas11,12. Un cuarto paso se introdujo para obtener piezas totalmente maduros por cultivar estos primeros PC con medio de la médula ósea células stromal acondicionadas o seleccionado factores de crecimiento de13. Estos equipos maduros podrían sobrevivir varios meses en vitro y secretan altas cantidades de inmunoglobulinas (figura 1). Curiosamente, nuestro modelo in vitro recapitula los cambios transcripcionales coordinados y el fenotipo de la B diferente a etapas de PC que puede ser detectado en vivo11,12,13,14 ,15. PC es las células raras y nuestro modelo de diferenciación in vitro permite para estudiar humano B para diferenciación de PC.

Protocol

El protocolo sigue las directrices de acuerdo con la declaración de Helsinki y acuerdo de centro de Hospital de la Universidad de Montpellier de recursos biológicos. 1. en el modelo de diferenciación de la célula de Plasma Vitro Normal Nota: PC se genera a través de una cultura de cuatro pasos11,12,13. Diferenciación y la amplificac…

Representative Results

El procedimiento general de diferenciación in vitro de PC normal se representa en la figura 1. Utilizando el protocolo presentado aquí, podríamos generar suficiente cantidad de células que no se podía obtener con ex vivo de muestras humanas. Aunque se ha investigado el papel de la compleja red de factores de transcripción implicados en la diferenciación de la PC, los mecanismos de regulación de redes de transcripción de diferenciación de PC claves s…

Discussion

En humanos, PC son células con etapas de diferenciación tiene lugar en lugares anatómicos que obstaculizan la caracterización biológico completo. Hemos desarrollado una in vitro B modelo de diferenciación de PC utilizando sistemas de cultivo de varios pasos donde varias combinaciones de moléculas de activación y citoquinas se aplican posteriormente para poder reproducir la diferenciación secuencial en el diferentes órganos/tejidos en vivo11,12,</su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por becas del INCA francés (Institut National du Cancer) cáncer de ITMO (MM & TT), ANR (Tie-Skip) e Instituto (PLBIO15-256).

Materials

anti-CD2 magnetic beads Invitrogen 11159D
Anti-CD138-APC Beckman-Coulter  B49219
Anti-CD19-APC BD 555415
Anti-CD20-PB Beckman-Coulter  B49208
Anti-CD27-PE BD 555441
Anti-CD38-PE Beckman-Coulter  A07779
Anti-histidine R&D Systems MAB050
CpG ODN(PT) Sigma T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*
G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T
human Transferin Sigma-Aldrich T3309
IFN-α Merck Intron A
IMDM Gibco 31980-022
Recombinan Human CD40L-hi R&D Systems 2706-CL
Recombinant Human APRIL R&D Systems 5860-AP-010
Recombinant Human IL-10 R&D Systems 217-IL-
Recombinant Human IL-15 Peprotech 200-15-10ug
Recombinant Human IL-2 Protein R&D Systems 202-IL-
Recombinant Human IL-6 Peprotech 200-06
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Jourdan, M., de Boussac, H., Viziteu, E., Kassambara, A., Moreaux, J. In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells. J. Vis. Exp. (143), e58929, doi:10.3791/58929 (2019).
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