JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

В модели дифференциации in Vitro клеток человека обычной памяти B для долгоживущих клеток плазмы

Published: January 20, 2019
doi:
10.3791/58929
, , , ,
1IGH, CNRS,Univ Montpellier, 2Laboratory for Monitoring Innovative Therapies, Department of Biological Hematology,CHU Montpellier, 3UFR de Médecine,Univ Montpellier

Summary

С помощью системы многоступенчатого культуры, мы доклад в vitro клетки B модели дифференцировки клеток плазмы.

Abstract

Клетки плазмы (шт) выделяют большое количество антител и развиваются из клеток B, которые были активированы. Компьютеры являются редкие клеток, расположенных в костный мозг или слизистую оболочку и обеспечить гуморального иммунитета. Из-за их низкой частоты и местоположение, трудно изучение ПК в человека. Мы сообщили B для ПК модель в пробирке дифференциации, с использованием выбранных комбинаций цитокинов и активация молекул, которые позволяют воспроизводить последовательный клеточная дифференцировка, происходящих в естественных условиях. В этой модели в пробирке, памяти, клетки B (MBCs) будет дифференцироваться в предварительно plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs), рано ПК и наконец, в долгоживущих ПК, с фенотипом близко к их коллег в здоровых индивидуалах. Мы также построили открытый доступ Биоинформатика инструменты для анализа наиболее известных информации от GEP данные, относящиеся к ПК дифференциации. Эти ресурсы могут использоваться для изучения человека B ПК дифференциации и в текущем исследовании, мы исследовали регулирование выражение гена эпигенетических факторов во время человека B PC дифференциации.

Introduction

Дифференцировки лимфоцитов в плазматические клетки (шт) имеет важное значение для гуморального иммунитета и защиты узла против инфекций1. B для PC дифференциация ассоциируется с значительные изменения в транскрипции потенциала и метаболизм для размещения до антитела секрецию. Факторы транскрипции, которые контролируют Б PC дифференциации широко изучены и выявлены эксклюзивные сетей, в том числе B – и PC-определенного транскрипции факторы (TFs)2. В B-клеток PAX5, BCL6 и BACH2 TFs являются хранителями клетки B личность2,3. Индукции IRF4, PRDM1 кодировки BLIMP1 и XBP1 PC TF будет потушить B клетки генов и побудить скоординированного антитела секретирующих клеток транскрипционный анализ программы3,4,5. Эти скоординированные транскрипционный анализ изменения связаны с активацией транскрипции генов Ig вместе с переход от мембраны Присоединенная форма выделяется форму иммуноглобулин тяжелые цепи2,3, 4. B PC дифференциации связан с индукции генов, участвующих в эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи функции сочетанной с активацией ответ (УНР) разворачивались белка известен играть ключевую роль в ПК путем размещения синтез выделяется иммуноглобулины6,7. TF XBP1 играет важную роль в этой клеточной адаптации8,9,10.

B клетки и ПК являются ключевыми игроками гуморального иммунитета. Понимание биологических процессов, управления, производства и выживания нормальных клеток плазмы имеет решающее значение в терапевтических вмешательств, которые нужны для обеспечения эффективного иммунного ответа и предотвратить аутоиммунных заболеваний или иммунодефицит. PC являются редкими клетки с ранних стадиях дифференцировки происходящих в анатомических местах, которые препятствуют полной биологических характеристик, особенно в человека. С помощью системы многоступенчатого культуры, мы сообщали в пробирке B PC дифференциация модели. Эта модель воспроизводит последовательных ячеек дифференцировки и созревания, происходящих в различных органах в vivo11,12,13. В качестве первого шага клетки памяти B сначала активируются для четырех дней CD40 лиганд, oligodeoxynucleotides и цитокина комбинации и дифференцироваться в preplasmablasts (PrePBs). В качестве второго шага preplasmablasts вынуждены дифференцироваться в plasmablasts (PBs) путем удаления CD40L и oligodeoxynucleotides стимуляции и изменения цитокинов комбинации. В качестве третьего шага plasmablasts вынуждены дифференцироваться в начале ПК, изменив цитокина сочетание11,12. Четвертый шаг был введен получить полностью зрелые ПК путем культивирования этих ранних ПК с костного стромальные клетки кондиционером среднего или выбранные факторы роста13. Эти пожилые ПК могут выжить несколько месяцев в пробирке и выделяют большое количество иммуноглобулина (рис. 1). Интересно, что наши экстракорпоральное моделью резюмирует скоординированных transcriptional изменений и фенотип различных B PC этапов, которые могут быть обнаружены в естественных условиях11,12,13,14 ,15. Компьютеры являются редкие клетки и наша модель в пробирке дифференциация позволяет изучить человека B PC дифференциации.

Protocol

Протокол придерживается руководящих принципов, в соответствии с Хельсинкской декларации и соглашения центра больницы университета Монпелье биологических ресурсов. 1. в Vitro нормальной клетки плазмы дифференциация модели Примечание: Компьютеры со…

Representative Results

Общая процедура экстракорпорального нормальный PC дифференциации представлена на рисунке 1. С использованием протокола, представленные здесь, мы могли бы генерировать достаточное количество клеток, которые не могут быть получены с ex vivo человека образ?…

Discussion

В человека PC являются редкими клетки с этапами дифференцировки происходящих в анатомических местах, которые препятствуют полной биологической характеристике. Мы разработали в пробирке B PC дифференциация модель с использованием культуры многоступенчатой системы, где различные комби?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантов от французского ИНКОВ (Институт национального du рака) институт (PLBIO15-256), НРУ (галстук-скип) и НИУ ИТМО рака (мм & TT).

Materials

anti-CD2 magnetic beads Invitrogen 11159D
Anti-CD138-APC Beckman-Coulter  B49219
Anti-CD19-APC BD 555415
Anti-CD20-PB Beckman-Coulter  B49208
Anti-CD27-PE BD 555441
Anti-CD38-PE Beckman-Coulter  A07779
Anti-histidine R&D Systems MAB050
CpG ODN(PT) Sigma T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*
G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T
human Transferin Sigma-Aldrich T3309
IFN-α Merck Intron A
IMDM Gibco 31980-022
Recombinan Human CD40L-hi R&D Systems 2706-CL
Recombinant Human APRIL R&D Systems 5860-AP-010
Recombinant Human IL-10 R&D Systems 217-IL-
Recombinant Human IL-15 Peprotech 200-15-10ug
Recombinant Human IL-2 Protein R&D Systems 202-IL-
Recombinant Human IL-6 Peprotech 200-06
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
  2. Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15 (3), 160-171 (2015).
  3. Shaffer, A. L., et al. Blimp-1 orchestrates plasma cell differentiation by extinguishing the mature B cell gene expression program. Immunity. 17 (1), 51-62 (2002).
  4. Minnich, M., et al. Multifunctional role of the transcription factor Blimp-1 in coordinating plasma cell differentiation. Nature Immunology. 17 (3), 331-343 (2016).
  5. Klein, U., et al. Transcription factor IRF4 controls plasma cell differentiation and class-switch recombination. Nature Immunology. 7 (7), 773-782 (2006).
  6. Gass, J. N., Gunn, K. E., Sriburi, R., Brewer, J. W. Stressed-out B cells? Plasma-cell differentiation and the unfolded protein response. Trends in Immunology. 25 (1), 17-24 (2004).
  7. Goldfinger, M., Shmuel, M., Benhamron, S., Tirosh, B. Protein synthesis in plasma cells is regulated by crosstalk between endoplasmic reticulum stress and mTOR signaling. European Journal of Immunology. 41 (2), 491-502 (2011).
  8. Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
  9. Shaffer, A. L., et al. XBP1, downstream of Blimp-1, expands the secretory apparatus and other organelles, and increases protein synthesis in plasma cell differentiation. Immunity. 21 (1), 81-93 (2004).
  10. Reimold, A. M., et al. Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1. Nature. 412 (6844), 300-307 (2001).
  11. Jourdan, M., et al. Characterization of a transitional preplasmablast population in the process of human B cell to plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 187 (8), 3931-3941 (2011).
  12. Jourdan, M., et al. An in vitro model of differentiation of memory B cells into plasmablasts and plasma cells including detailed phenotypic and molecular characterization. Blood. 114 (25), 5173-5181 (2009).
  13. Jourdan, M., et al. IL-6 supports the generation of human long-lived plasma cells in combination with either APRIL or stromal cell-soluble factors. Leukemia. , (2014).
  14. Kassambara, A., et al. Global miRNA expression analysis identifies novel key regulators of plasma cell differentiation and malignant plasma cell. Nucleic Acids Research. 45 (10), 5639-5652 (2017).
  15. Kassambara, A., et al. GenomicScape: an easy-to-use web tool for gene expression data analysis. Application to investigate the molecular events in the differentiation of B cells into plasma cells. PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004077 (2015).
  16. Miremadi, A., Oestergaard, M. Z., Pharoah, P. D., Caldas, C. Cancer genetics of epigenetic genes. Human Molecular Genetics. 16, 28-49 (2007).
  17. Pei, H., et al. The histone methyltransferase MMSET regulates class switch recombination. Journal of Immunology. 190 (2), 756-763 (2013).
  18. Le Gallou, S., et al. IL-2 requirement for human plasma cell generation: coupling differentiation and proliferation by enhancing MAPK-ERK signaling. Journal of Immunology. 189 (1), 161-173 (2012).
  19. Cocco, M., et al. In vitro generation of long-lived human plasma cells. Journal of Immunology. 189 (12), 5773-5785 (2012).
  20. Leung-Hagesteijn, C., et al. Xbp1s-negative tumor B cells and pre-plasmablasts mediate therapeutic proteasome inhibitor resistance in multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 289-304 (2013).
  21. Orlowski, R. Z. Why proteasome inhibitors cannot ERADicate multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 275-277 (2013).
  22. Ding, B. B., Bi, E., Chen, H., Yu, J. J., Ye, B. H. IL-21 and CD40L synergistically promote plasma cell differentiation through upregulation of Blimp-1 in human B cells. Journal of Immunology. 190 (4), 1827-1836 (2013).
  23. Tsai, C. M., et al. Galectin-1 promotes immunoglobulin production during plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 181 (7), 4570-4579 (2008).
  24. Tsai, C. M., et al. Galectin-1 and galectin-8 have redundant roles in promoting plasma cell formation. Journal of Immunology. 187 (4), 1643-1652 (2011).
  25. Anginot, A., Espeli, M., Chasson, L., Mancini, S. J., Schiff, C. Galectin 1 modulates plasma cell homeostasis and regulates the humoral immune response. Journal of Immunology. 190 (11), 5526-5533 (2013).
  26. Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. Journal of Immunology. 188 (3), 1283-1291 (2012).
  27. Belnoue, E., et al. APRIL is critical for plasmablast survival in the bone marrow and poorly expressed by early-life bone marrow stromal cells. Blood. 111 (5), 2755-2764 (2008).
  28. Huard, B., et al. APRIL secreted by neutrophils binds to heparan sulfate proteoglycans to create plasma cell niches in human mucosa. Journal of Clinical Investigation. 118 (8), 2887-2895 (2008).
  29. Ame-Thomas, P., et al. Human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and lymphoid organs support tumor B-cell growth: role of stromal cells in follicular lymphoma pathogenesis. Blood. 109 (2), 693-702 (2007).
  30. Ramachandrareddy, H., et al. BCL6 promoter interacts with far upstream sequences with greatly enhanced activating histone modifications in germinal center B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (26), 11930-11935 (2010).
  31. Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends in Immunology. 34 (9), 460-470 (2013).
  32. Miles, R. R., Crockett, D. K., Lim, M. S., Elenitoba-Johnson, K. S. Analysis of BCL6-interacting proteins by tandem mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. 4 (12), 1898-1909 (2005).
  33. McManus, S., et al. The transcription factor Pax5 regulates its target genes by recruiting chromatin-modifying proteins in committed B cells. The EMBO Journal. 30 (12), 2388-2404 (2011).
  34. Ahmadnejad, M., et al. Elevated expression of DNMT1 is associated with increased expansion and proliferation of hematopoietic stem cells co-cultured with human MSCs. Blood Research. 52 (1), 25-30 (2017).
  35. Beguelin, W., et al. EZH2 is required for germinal center formation and somatic EZH2 mutations promote lymphoid transformation. Cancer Cell. 23 (5), 677-692 (2013).
  36. Herviou, L., Cavalli, G., Cartron, G., Klein, B., Moreaux, J. EZH2 in normal hematopoiesis and hematological malignancies. Oncotarget. 7 (3), 2284-2296 (2016).
  37. Beguelin, W., et al. EZH2 enables germinal centre formation through epigenetic silencing of CDKN1A and an Rb-E2F1 feedback loop. Nature Communications. 8 (1), 877 (2017).
  38. Herviou, L., et al. PRC2 targeting is a therapeutic strategy for EZ score defined high-risk multiple myeloma patients and overcome resistance to IMiDs. Clinical Epigenetics. 10 (1), 121 (2018).
  39. Asangani, I. A., et al. Characterization of the EZH2-MMSET histone methyltransferase regulatory axis in cancer. Molecular Cell. 49 (1), 80-93 (2013).
  40. Pei, H., et al. MMSET regulates histone H4K20 methylation and 53BP1 accumulation at DNA damage sites. Nature. 470 (7332), 124-128 (2011).
  41. Cui, J., et al. EHMT2 inhibitor BIX-01294 induces apoptosis through PMAIP1-USP9X-MCL1 axis in human bladder cancer cells. Cancer Cell International. 15 (1), 4 (2015).
  42. Santo, L., et al. Preclinical activity, pharmacodynamic, and pharmacokinetic properties of a selective HDAC6 inhibitor, ACY-1215, in combination with bortezomib in multiple myeloma. Blood. 119 (11), 2579-2589 (2012).
  43. Amengual, J. E., et al. Dual Targeting of Protein Degradation Pathways with the Selective HDAC6 Inhibitor ACY-1215 and Bortezomib Is Synergistic in Lymphoma. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4663-4675 (2015).
  44. Schoenhals, M., et al. Forced KLF4 expression increases the generation of mature plasma cells and uncovers a network linked with plasma cell stage. Cell Cycle. 15 (14), 1919-1928 (2016).

Tags

In Vitro DifferentiationHuman Normal Memory B CellsLong-lived Plasma CellsPlasma Cell DifferentiationB2 Plasma Cell DifferentiationTranscriptional ChangesPhenotypeBioinformatic ToolsMemory B Cell PurificationCD40 LigandAnti-polyhistidine Monoclonal Antibody

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Jourdan, M., de Boussac, H., Viziteu, E., Kassambara, A., Moreaux, J. In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells. J. Vis. Exp. (143), e58929, doi:10.3791/58929 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image