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Immunology and Infection

No modelo de diferenciação Vitro de células de memória humana Normal B de plasmócitos de vida longa

Published: January 20, 2019
doi:
10.3791/58929
, , , ,
1IGH, CNRS,Univ Montpellier, 2Laboratory for Monitoring Innovative Therapies, Department of Biological Hematology,CHU Montpellier, 3UFR de Médecine,Univ Montpellier

Summary

Utilizando sistemas de cultura de várias etapas, relatamos uma células B in vitro para o modelo de diferenciação de células plasmáticas.

Abstract

Os plasmócitos (PCs) secretam grandes quantidades de anticorpos e desenvolver a partir de células B que foram ativadas. PCs são raras células localizadas na medula óssea ou mucosa e garantir imunidade humoral. Devido à sua baixa frequência e localização, o estudo dos PCs é difícil em humanos. Nós relatamos um B para PC modelo de diferenciação in vitro usando combinações selecionadas de citocinas e a ativação de moléculas que permitem reproduzir a diferenciação de células sequenciais ocorrem in vivo. Neste modelo in vitro, células B (MBCs) irão diferenciar em pre-plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs), cedo PCes de memória e, finalmente, em Long-lived PCs, com um fenótipo perto de suas contrapartes em indivíduos saudáveis,. Também construímos uma acesso aberto bioinformática ferramentas para analisar as informações mais importantes de dados GEP relacionados à diferenciação de PC. Esses recursos podem ser usados para estudar B humano para diferenciação de PC e no atual estudo, investigamos a regulação da expressão gênica de fatores epigenéticos durante B humano para diferenciação de PC.

Introduction

A diferenciação das células B para células plasmáticas (PCs) é essencial para a imunidade humoral e proteger o hospedeiro contra infecções1. B a diferenciação de PC está associado com grandes mudanças na capacidade de transcrição e metabolismo para acomodar a secreção de anticorpos. Os fatores de transcrição que controlam a B para diferenciação de PC têm sido muito estudados e revelou redes exclusivas incluindo transcrição B PC-específicas e fatores (TFs)2. Em células B, PAX5, BCL6 e BACH2 TFs são os guardiães das células B identidade2,3. Indução de IRF4, PRDM1 , BLIMP1 e XBP1 PC TF de codificação irá extinguir genes de células B e induzir uma coordenada desegregação celular programa transcriptional3,4,5. Essas alterações transcricionais coordenadas estão associadas com a ativação de transcrição de genes de Ig juntamente com um interruptor de forma a membrana-limite para a forma secretada da imunoglobulina cadeia pesada2,3, 4. B para diferenciação de PC está relacionada com a indução de genes envolvidos no retículo endoplasmático e complexo de Golgi funções concomitante com ativação de resposta (UPR) unfolded da proteína conhecida por desempenhar um papel-chave no PC por acomodar a síntese de secretado imunoglobulinas6,7. A XBP1 de TF desempenha um papel importante nesta adaptação celular8,9,10.

As células B e PCs são jogadores-chave da imunidade humoral. Noções básicas sobre o biológico processos que controlam a produção e a sobrevivência das células de plasma normais é crítico em intervenções terapêuticas que precisam assegurar eficientes respostas imunes e prevenir auto-imunidade ou deficiência imunológica. PC são raras células com estágios iniciais de diferenciação que ocorrem em locais anatómicos que dificultam a caracterização biológica, particularmente em humanos. Utilizando sistemas de cultura de várias etapas, registramos um B in vitro para PC modelo de diferenciação. Este modelo reproduz a diferenciação celular sequencial e maturação ocorrendo em diferentes órgãos em vivo11,12,13. Numa primeira fase, as células de memória B são ativado pela primeira vez por quatro dias por combinação de CD40 ligante, oligodeoxynucleotides e citocinas em diferenciarem em preplasmablasts (PrePBs). Em uma segunda etapa, preplasmablasts são induzidas de se diferenciarem em plasmablasts (PBs) removendo estimulação CD40L e oligodeoxynucleotides e mudar a combinação do cytokine. Em uma terceira etapa, plasmablasts são induzidos a se diferenciar em PCs cedo, alterando a combinação de citocina11,12. Um quarto passo foi introduzido para obter PCs totalmente maduros pelo cultivo destes primeiros PCs com meio condicionados de células do estroma de medula óssea ou selecionado de fatores de crescimento13. Estes PCs maduros podem sobreviver vários meses in-vitro e secretam quantidades elevadas de imunoglobulina (Figura 1). Curiosamente, o nosso modelo in vitro recapitula as alterações transcricionais coordenadas e o fenótipo do B diferente fases de PC que pode ser detectado em vivo11,12,13,14 ,15. PCs são células raras e nosso modelo de diferenciação in vitro permite estudar B humano para diferenciação de PC.

Protocol

O protocolo segue as diretrizes em conformidade com o acordo do Centro Hospital Universidade de Montpellier para recursos biológicos e a declaração de Helsinque. 1. no modelo de diferenciação de células plasmáticas Vitro Normal Nota: PCes são gerados através de uma cultura de quatro etapas11,12,13. Diferenciação e amplificaçã…

Representative Results

O procedimento geral de diferenciação in vitro de PC normal é representado na Figura 1. Usando o protocolo apresentado aqui, nós poderia gerar uma quantidade adequada de células que não pode ser obtido com ex vivo amostras humanas. Embora o papel da rede complexa de fatores de transcrição envolvidos na diferenciação do PC tem sido investigado, os mecanismos de regulação principais redes de transcrição de diferenciação de PC permanecem pouco co…

Discussion

Em humanos, PC são raras células com estágios de diferenciação, ocorrendo em locais anatómicos que dificultam a caracterização biológica. Nós desenvolvemos um B in vitro para PC modelo de diferenciação usando sistemas de cultura de várias etapas onde várias combinações de moléculas de ativação e citocinas posteriormente são aplicadas a fim de reproduzir a diferenciação celular sequencial ocorrendo na diferentes órgãos/tecidos em vivo11,12<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por concessões do INCA francês (Institut National du Cancer) Instituto (PLBIO15-256), ANR (Tie-Skip) e câncer ITMO (MM & TT).

Materials

anti-CD2 magnetic beads Invitrogen 11159D
Anti-CD138-APC Beckman-Coulter  B49219
Anti-CD19-APC BD 555415
Anti-CD20-PB Beckman-Coulter  B49208
Anti-CD27-PE BD 555441
Anti-CD38-PE Beckman-Coulter  A07779
Anti-histidine R&D Systems MAB050
CpG ODN(PT) Sigma T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*
G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T
human Transferin Sigma-Aldrich T3309
IFN-α Merck Intron A
IMDM Gibco 31980-022
Recombinan Human CD40L-hi R&D Systems 2706-CL
Recombinant Human APRIL R&D Systems 5860-AP-010
Recombinant Human IL-10 R&D Systems 217-IL-
Recombinant Human IL-15 Peprotech 200-15-10ug
Recombinant Human IL-2 Protein R&D Systems 202-IL-
Recombinant Human IL-6 Peprotech 200-06
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Jourdan, M., de Boussac, H., Viziteu, E., Kassambara, A., Moreaux, J. In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells. J. Vis. Exp. (143), e58929, doi:10.3791/58929 (2019).
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