وهنا، نقدم بروتوكول لإعداد الخلايا المفردة من الغدة الصعترية مورين، البنكرياس تصب العقدة الليمفاوية والطحال إلى مواصلة دراسة هذه الخلايا باستخدام التدفق الخلوي. وبالإضافة إلى ذلك، تم استخدام هذا البروتوكول لتحديد مجموعات فرعية الخلايا التائية التنظيمية باستخدام التدفق الخلوي.
لدينا الجهاز المناعي يتكون من عدد ومتنوعة من الخلايا المناعية بما في ذلك الخلايا خلايا (تريغ) T التنظيمية. ويمكن تقسيم الخلايا تريغ مجموعات فرعية اثنين والغدة الصعترية المشتقة من الخلايا تريغ (تريج) والمستحثه محيطيا تريغ (بتريج) الخلايا. وهي موجودة في مختلف أجهزة الجسم ويمكن تمييزها بعلامات معينة، مثل هيليوس ونيوروبيلين 1. وأفيد أن خلايا تريج وظيفيا القمعية أكثر من الخلايا بتريج. ولذلك، من المهم تحديد نسبة خلايا تريج وبتريج عند التحقيق في الخلية غير المتجانسة السكان. وهنا، جمعنا الغدة الصعترية الغدد الليمفاوية تجفيف البنكرياس والطحال من الفئران السكري غير السمنة نورموجليسيميك لتمييز خلايا تريج من الخلايا بتريج استخدام التدفق الخلوي. قمنا بإعداد تعليق خلية واحدة فقط من هذه الأجهزة يدوياً. Fluorochrome مترافق السطحية CD4، CD8، CD25، واستخدمت الأجسام المضادة نيوروبيلين 1 وصمة عار الخلايا. وضعوا في الثلاجة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، كانت ملطخة الخلايا fluorochrome مترافق أضداد Foxp3 وهيليوس داخل الخلايا. واستخدمت هذه العلامات لوصف المجموعات اثنين من الخلايا تريغ. هذا البروتوكول يوضح طريقة بسيطة ولكنها عملية لإعداد الخلايا المفردة من الغدة الصعترية مورين، البنكرياس تصب العقدة الليمفاوية والطحال واستخدامها لأغراض تحليل سيتوميتريك تدفق اللاحقة.
خلايا تي (تريغ) التنظيمية حاسمة بالنسبة للتوازن للجهاز المناعي. تعرف الخلايا تريغ التعبير عن المستضدات السطحية CD4 و CD25، والنسخ عامل فورخيد مربع P3 (Foxp3)1،،من23. وأظهرت ساكاجوتشى et al. أولاً أعرب CD25 هو مؤثرا في تي القامع الخلايا في الفئران4، الذي ينص مراقبة رائدة للتعرف على الخلايا البشرية تريغ. تريغ خلايا تلعب دوراً مركزياً في منأى عن التسامح بما تمارسه من قدرة قمعية عبر مجموعة متنوعة من الآليات، بما في ذلك سيتوليسيس عن طريق إفراز جرانزيميس للحث على المبرمج واستهلاك سيتوكين وتثبيط من خلال التعبير عن السامة للخلايا اللمفاويات التائية مستضد 45. بالإضافة إلى ذلك، أنها يمكن أن تفرز السيتوكينات المثبطة مثل تحويل عامل النمو بيتا (TGF-β)، انترلوكين-10 (إيل-10)، وايل-355. يمكن بطبيعة الحال أن يستمد تريغ خلايا من الغدة الصعترية، في هذه الحالة يتم تعيينهم الغدة الصعترية المشتقة من الخلايا تريغ (تريج)، أو أنهم يمكن أن يتسبب في الأجهزة الطرفية في هذا الحالة تسمى محيطيا المستحث تريغ (بتريج) الخلايا.
هيليوس، عضو الأسرة عامل النسخ إيكاروس، أفيد بأن علامة للتمييز بين خلايا تريج والخلايا بتريج6. في وقت لاحق، أفادت مجموعتين أخريين أن مستقبل الثالث سيمافورين، نيوروبيلين 1 (Nrp1)، يمكن أن تخدم كعلامة سطحية لخلايا تريج تحت بعض الظروف7،8. ومع ذلك، أظهرت سينغ et al. أن Helios علامة أفضل في هذا السياق بالسذاجة الفئران9.
مجموعات فرعية الخلايا تريغ تلعب دوراً محوريا في الحفاظ على التوازن في الجهاز المناعي، وفي الحماية من العدوى والمناعة الذاتية. ولذلك، من المهم تحديد أرقام ونسب هؤلاء السكان في الأنسجة اللمفاوية وغير اللمفاوية على حد سواء. ولتحقيق ذلك، يتعين على المرء أن إعداد تعليق خلية واحدة فقط من هذه الأجهزة. تم وصف عدد من البروتوكولات أو المستخدمة في الدراسات السابقة. أساسا، ديسوسياتورس التلقائي قد استخدمت في التقارير المنشورة سابقا10،11. ديسوسياتورس التلقائي باستخدام مناسب وتوفير الوقت، وإنما إجراء مكلفة. ولذلك، استخدمنا أسلوب يدوي لإعداد تعليق خلية مفردة من مورين الغدة الصعترية الغدد الليمفاوية تجفيف البنكرياس (بدلنس) والطحال من الفئران (الإيماءة) السكري غير السمنة نورموجليسيميك، وعزل الخلايا المفردة من هذه الأجهزة. وقد استخدم هذا الأسلوب في دراساتنا السابقة ووجدنا أن الطريقة اليدوية لإعداد تعليق خلية مفردة بكفاءة ديسوسياتور التلقائي الأسلوب9،12،،من1314. وعلاوة على ذلك، استخدمنا التدفق الخلوي لتحديد نسب CD4+CD8–CD25+Foxp3+ تريغ خلايا ومجموعات فرعية من تريغ الخلايا خلايا تريج وبتريج. تم تمييز خلايا تريج وبتريج استخدام هيليوس و Nrp1 كعلامات لخلايا تريج. وهكذا، تشير النتائج التي توصلنا إليها أن الطريقة اليدوية لإعداد الخلايا المفردة العمل بكفاءة، ويمكن استخدام تعليق خلية واحدة مستعدة كذلك لدراسات استخدام التدفق الخلوي.
في هذه الدراسة، ونحن عزل الخلايا المفردة من الغدد الغدة الصعترية، بدلنس والطحال من الفئران إيماءة، والتحقيق في التعبير عن هيليوس و Nrp1 في خلايا CD4+CD8–CD25+Foxp3+ تريغ الخلايا باستخدام التدفق الخلوي. واستخدمت في هذه الدراسة، الفئران إيماءة، الذي هو نموذج مورين من داء الس?…
The authors have nothing to disclose.
هذه الدراسة دعم مالي من مجلس البحوث السويدية، اكسودياب، ومؤسسة السكري السويدية والصندوق السكري الطفل السويدي، سيب ديابيتيسفوندين و O.E. أوتش ادلا جوهانسونس فيتينسكابليجا ستيفتيلسي. المؤلف يود أيضا بفضل كل علا كارلسون وساندلر ستيلان ليدعم والمناقشات.
NOD mice | In-house breading | ||
HBSS | Statens veterinärmedicinska anstalt | 991750 | |
RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10X) |
eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody | R&D Systems | FAB5994A | |
FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody | BioLegend | 137220 | |
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | CORNING | 352235 | A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap |
Tube 15ml, 120x17mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
Micro tube 1.5ml | Sarstedt | 72.690.001 | |
disposable scintillation vials | WHEATON | ||
Flow cytometry | BD | ||
Flow cytometry analysis software | Inivai Technologies | Flowlogic |