במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול להכנת תאים בודדים של בלוטת התימוס מאתר הלבלב ניקוז הלימפה והטחול ללימוד נוסף תאים אלה באמצעות cytometry זרימה. בנוסף, פרוטוקול זה שימש לקביעת תת-קבוצות של הרגולציה ותאי T באמצעות cytometry זרימה.
המערכת החיסונית שלנו מורכב מספר ומגוון של תאים חיסוניים כולל הרגולציה ותאי T תאים (Treg). Treg תאים מתחלקים שתי קבוצות משנה, תאים Treg (tTreg) נגזר הרתי ותאים Treg (pTreg) באופן עקיף המושרה. הם נמצאים איברים שונים של הגוף שלנו, ניתן להבחין באמצעות סמנים ספציפיים, כגון הליוס ו- Neuropilin 1. בעבר דווח כי תאים tTreg הם באופן פונקציונלי יותר מדכא מאשר תאים pTreg. לכן, חשוב לקבוע את הפרופורציה של תאים הן tTreg והן pTreg, כאשר חוקרים אוכלוסיות הטרוגניות תא. במסמך זה, אספנו הרתי בלוטות לימפה המנקזים הלבלב, טחולים מ normoglycemic בעכברים סוכרתיים שאינם שמנים להבחין tTreg תאים מתאי pTreg באמצעות cytometry זרימה. הכנו באופן ידני את המתלים תא בודד מן האיברים האלה. Fluorochrome מצומדת CD4 משטח, CD8, CD25, נוגדנים Neuropilin 1 שימשו כדי להכתים את התאים. הם נשמרו במקרר למשך הלילה. ביום הבא, התאים היו מוכתמים נוגדנים Foxp3 ואת הליוס תאיים fluorochrome מצומדת. סמנים אלה שימשו כדי לאפיין את שתי קבוצות משנה של תאים Treg. פרוטוקול זה מדגים דרך פשוטה אך מעשית כדי להכין תאים בודדים של בלוטת התימוס מאתר הלבלב ניקוז הלימפה והטחול, להשתמש בהם עבור ניתוח cytometric תזרים עוקבות.
הרגולציה ותאי T (Treg) הם קריטיים עבור הומאוסטזיס של מערכת החיסון. Treg תאים מוגדרים על-ידי הביטוי של פני השטח אנטיגנים CD4 ו CD25 ולאחר שעתוק מקדם forkhead P3 תיבת (Foxp3)1,2,3. Sakaguchi et al. קודם הראה כי CD25 מתבטאת צורונים על תאי T משתיק קול עכברים4, אשר סיפקה תצפית חלוצית לצורך זיהוי תאים אנושיים Treg. תאים Treg לשחק תפקיד מרכזי סובלנות המערכת החיסונית מצידה בעל יכולת מדכאים באמצעות מגוון של מנגנונים, כולל cytolysis באמצעות ההפרשה של granzymes כדי לגרום אפופטוזיס, צריכת ציטוקין וניגוד דרך הביטוי של ציטוטוקסיות לימפוציטים-T אנטיגן 45. בנוסף, הם יכולים להפריש ציטוקינים מעכבות כגון הפיכת גורם הגדילה בטא (TGF-β), אינטרלויקין-10 (IL-10) ו- IL-355. Treg תאים באופן טבעי הנגזרות התימוס, ובמקרה הזה והם מיועדים תאים Treg (tTreg) נגזר הרתי, או שהם יכולה להיגרם באיברים ההיקפיים באותו מקרה נקראים תאים Treg (pTreg) באופן עקיף המושרה.
הליוס, חבר של משפחת פקטור שעתוק Ikaros, דווח כדי להיות סמן להבחנה בין תאים tTreg, pTreg תאים6. מאוחר יותר, שתי קבוצות אחרות דיווחו כי Neuropilin 1 (Nrp1), קולטן השלישי semaphorin, יכול לשמש כסמן משטח של תאים tTreg תחת תנאים מסוימים,7,8. למרות זאת, סינג ואח הראו כי הליוס הוא סמן טוב יותר בהקשר זה נאיבי עכברים9.
קבוצות משנה של תאים Treg לשחק תפקיד מרכזי שמירה על הומאוסטזיס מערכת החיסון, הגנה מפני מחלת חיסון עצמי ולדלקת. לכן, חשוב לקבוע את המספרים ואת הפרופורציות של אוכלוסיות אלה ברקמות הלימפה והן הלא-הלימפה. כדי להשיג זאת, יש להכין את המתלים תא בודד מן האיברים האלה. מספר פרוטוקולים המתוארים או בשימוש במחקרים קודמים. בעיקר, dissociators אוטומטי שימשו דוחות שפורסמו בעבר10,11. שימוש dissociators אוטומטי הוא נוח והוא חסכון בזמן, אבל זה הליך יקר. לכן, השתמשנו בשיטה ידנית כדי להכין המתלים תא בודד מאתר בלוטות הרתי, הלבלב ניקוז הלימפה (PDLNs), טחולים normoglycemic (הנד) שאינו שמנים בעכברים סוכרתיים, תאים בודדים מבודדת מן האיברים האלה. בשיטה זו נעשה שימוש במחקרים קודמים שלנו ומצאנו כי השיטה הידנית להכנת התליה תא בודד הוא יעיל כמו dissociator אוטומטי שיטה9,12,13,14. יתר על כן, השתמשנו cytometry זרימה כדי לקבוע את הפרופורציות של CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg תאים, תת-קבוצות של Treg תאים תאים tTreg ו- pTreg. התאים tTreg ו- pTreg היו מכובדים באמצעות הליוס Nrp1 כסמני תא tTreg. לכן, התוצאות שלנו עולה כי השיטה הידנית עבור הכנת את התאים לעבוד בצורה יעילה המתלים מוכן תא בודד יכול לשמש עוד יותר עבור מחקרים באמצעות cytometry זרימה.
במחקר זה, אנחנו מבודדים תאים בודדים בלוטות הרתי, PDLNs, טחולים של עכברים הנהון, חקרה את הביטוי של הליוס, Nrp1 ב CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg תאים באמצעות cytometry זרימה. במחקר הנוכחי, הנהון עכברים שימשו, אשר הוא מודל מאתר של סוכרת מסוג 1. במחקר הקודם, השתמשנו פראי סוג העכבר זנים CD-1 ועכברים C57B…
The authors have nothing to disclose.
המחקר הנוכחי נתמך כלכלית על ידי המועצה למחקר השבדי, EXODIAB, קרן סוכרת שוודית, קרן סוכרת ילד שבדי, סאב Diabetesfonden רוצה שתיכנס לשם ו Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. המחברים גם רוצה תודה לכל-אולה Carlsson, סטלאן סנדלר שלהם תומך ודיונים.
NOD mice | In-house breading | ||
HBSS | Statens veterinärmedicinska anstalt | 991750 | |
RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10X) |
eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody | R&D Systems | FAB5994A | |
FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody | BioLegend | 137220 | |
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | CORNING | 352235 | A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap |
Tube 15ml, 120x17mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
Micro tube 1.5ml | Sarstedt | 72.690.001 | |
disposable scintillation vials | WHEATON | ||
Flow cytometry | BD | ||
Flow cytometry analysis software | Inivai Technologies | Flowlogic |