Summary

Determinación de subconjuntos de células T reguladoras en murino timo, pancreático drenaje del nodo de linfa y bazo mediante citometría de flujo

Published: February 27, 2019
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Summary

Adjunto, presentamos un protocolo para preparar las células de ratón timo, páncreas drena a ganglios linfáticos y el bazo a un estudio más profundo estas células mediante citometría de flujo. Además, este protocolo se utiliza para determinar los subconjuntos de células T reguladoras mediante citometría de flujo.

Abstract

Nuestro sistema inmunológico consiste en una cantidad y variedad de células inmunes, incluyendo las células T reguladoras (Treg) de células. Las células TReg pueden dividirse en dos subconjuntos, las células Treg (tTreg) derivadas tímicas y periférica inducida por las células Treg (pTreg). Están presentes en diversos órganos de nuestro cuerpo y pueden distinguirse por marcadores específicos, como Helios y la neuropilina 1. Se ha reportado que las células tTreg son funcionalmente más represivas que las células pTreg. Por lo tanto, es importante determinar la proporción de células tTreg y pTreg la investigación de poblaciones celulares heterogéneas. En este documento, recogimos las glándulas timo, nodos de linfa de drenaje pancreáticos y bazos de normoglucémicos ratones diabéticos no obesos para distinguir las células de tTreg de pTreg las células mediante citometría de flujo. Preparamos manualmente suspensiones de la célula de estos órganos. Fluorocromo había conjugado de superficie CD4, CD8, CD25, y anticuerpos de la neuropilina 1 fueron utilizados para teñir las células. Se guardaron en el refrigerador durante la noche. Al día siguiente, las células se tiñeron con fluorocromo conjugado con anticuerpos intracelulares de Foxp3 y Helios. Estos marcadores fueron usados para caracterizar los dos subconjuntos de células Treg. Este protocolo muestra una forma sencilla pero práctica para preparar las células de timo murino, drenaje de ganglios linfáticos y el bazo páncreas y utilizarlos para análisis cytometric del flujo posterior.

Introduction

Las células reguladoras T (Treg) son críticas para la homeostasis del sistema inmune. Las células TReg se definen por la expresión de antígenos de superficie CD4 y CD25 y el factor de transcripción forkhead de caja P3 (Foxp3)2,1,3. Sakaguchi et al demostró primero que CD25 se expresa constitutivamente en las células supresoras de T en ratones4, que proporciona una observación pionera para la identificación de las células Treg humanas. Las células TReg desempeñan un papel central en la tolerancia inmunológica ejerciendo una capacidad represiva a través de una variedad de mecanismos, incluyendo citólisis a través de la secreción de granzymes para inducir apoptosis, consumo de citoquinas y la inhibición a través de la expresión de citotóxicos Linfocitos T antígeno 45. Además, pueden secretar citoquinas inhibitorias como transformación de factor de crecimiento beta (TGF-β), interleucina-10 (IL-10) y IL-355. Las células TReg pueden naturalmente derivar el timo, en cuyo caso se señalan las células Treg (tTreg) derivadas tímicas, o puede ser inducidas en los órganos periféricos en que caso se llaman periférica inducida por las células Treg (pTreg).

Helios, un miembro de la familia de factores de transcripción Ikaros, fue divulgado para ser un marcador para distinguir entre las células tTreg y células de pTreg6. Más tarde, otros dos grupos informaron que la neuropilina 1 (Nrp1), un receptor III semaphorin, podría servir como un marcador de superficie para tTreg las células bajo ciertas condiciones7,8. Sin embargo, Singh et al han demostrado que Helios es un mejor marcador en este contexto en ingenuo ratones9.

Los subconjuntos de células Treg juegan un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis del sistema inmune y en la protección contra la infección y autoinmunidad. Por lo tanto, es importante determinar los números y proporciones de estas poblaciones en los tejidos linfoides y no linfoides. Para lograr esto, uno tiene que preparar suspensiones de la célula de estos órganos. Un número de protocolos ha sido descrito o utilizados en estudios anteriores. Principalmente, se han utilizado automáticas disociadores en informes previamente publicados10,11. Utilizando disociadores automáticas es conveniente y ahorro de tiempo, pero es un procedimiento costoso. Por lo tanto, hemos utilizado un método manual para preparar suspensiones de la célula de murinas glándulas timo, nodos de linfa de drenaje pancreáticos (PDLNs) y bazos de ratones de (cabeceo) diabéticos no obesos normoglucémicos y aislado las células de estos órganos. Este método se ha utilizado en nuestros anteriores estudios y se encontró que el método manual para la preparación de la suspensión de células individuales es tan eficiente como disociador automático método9,12,13,14. Además, hemos utilizado la citometría de flujo para determinar las proporciones de CD4+CD8CD25+Foxp3+ Treg células y los subconjuntos de Treg células tTreg y pTreg. Las células tTreg y pTreg fueron distinguidas con Helios y Nrp1 como marcadores para células de tTreg. Por lo tanto, nuestros resultados indican que el método manual para la preparación de las células funciona eficientemente y las suspensiones preparadas unicelular pueden utilizarse además para estudios mediante citometría de flujo.

Protocol

El Comité local de ética animal en Universidad de Uppsala aprobó la experimentación animal. 1. recolección de órganos de animales Los ratones de sacrificio mediante dislocación cervical. Coloque las glándulas timo y bazo en viales de centelleo de 20 mL o en tubos cónicos de 15 mL con 5 mL de Hanks´ equilibrada solución de sal (HBSS). PDLNs lugar en micro tubos de 1,5 mL con 1 mL de RPMI 1640. Utilice todo timo y bazo y el PDLNs.Nota: Órganos…

Representative Results

Para investigar la expresión de Nrp1 y Helios en células tTreg y pTreg, preparamos las células de las glándulas timo, PDLNs y bazos de ratones del cabeceo de normoglucémicos y teñido con los marcadores de células Treg CD4, CD25, Foxp3, Helios y Nrp1 para citometría de flujo Análisis. Los resultados fueron analizados como se muestra en el representante gating estrategias (figura 1). Encontramos que la proporción de células de Helios+ entr…

Discussion

En este estudio, aislado de las células de las glándulas timo, PDLNs y bazos de ratones NOD e investigado la expresión de Helios y Nrp1 en CD4+CD8CD25+Foxp3+ Treg células mediante citometría de flujo. En el presente estudio, se utilizaron ratones NOD, que es un modelo murino de diabetes tipo 1. En un estudio anterior, hemos utilizado el cepas tipo salvaje ratón CD-1 y ratones C57BL/6 investigar si Helios o Nrp1 es un mejor marcador para distinguir las células tTreg de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El presente estudio fue apoyado financieramente por el Consejo de investigación sueco, EXODIAB, la Fundación sueca de la Diabetes, el sueco niño Diabetes fondo, SEB Diabetesfonden y O.E. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. Autores también quisieran gracias por Ola Carlsson y Stellan Sandler por sus soportes y discusiones.

Materials

NOD mice In-house breading
HBSS Statens veterinärmedicinska anstalt 991750
RPMI-1640 Sigma-Aldrich R0883-500ML
NH4Cl EMD Millipore 1011450500
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set ThermoFisher 00-5523-00 Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10X)
eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer ThermoFisher 00-4222-26
CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience ThermoFisher 11-0042-85
CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience ThermoFisher 12-0251-83
BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a BD Biosciences 560182
Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody R&D Systems FAB5994A
FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience ThermoFisher 25-5773-82
Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody BioLegend 137220
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap CORNING 352235 A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap
Tube 15ml, 120x17mm, PP Sarstedt 62.554.002
Micro tube 1.5ml Sarstedt 72.690.001
disposable scintillation vials WHEATON
Flow cytometry BD
Flow cytometry analysis software Inivai Technologies Flowlogic

References

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  2. Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).
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Cite This Article
Luo, Z., Thorvaldson, L., Blixt, M., Singh, K. Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (144), e58848, doi:10.3791/58848 (2019).

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