Summary

Ermittlung der regulatorischen T Zelle Teilmengen in murinen Thymus, Pankreas, Entwässerung, Lymphknoten und Milz mit Durchflusszytometrie

Published: February 27, 2019
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Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um einzelne Zellen von murinen Thymus, Pankreas Entwässerung Lymphknoten und Milz, weiter zu studieren diese Zellen mittels Durchflusszytometrie vorzubereiten. Darüber hinaus wurde dieses Protokoll verwendet zur Bestimmung der Teilmengen von regulatorischen T-Zellen mit Durchflusszytometrie.

Abstract

Unser Immunsystem besteht aus einer Zahl und Vielfalt der immunen Zellen einschließlich der regulatorische T-Zellen (Treg)-Zellen. Treg-Zellen können in zwei Untergruppen, Zebrafischembryonen abgeleiteten Treg (tTreg) und peripher induzierte Treg (pTreg) Zellen unterteilt werden. Sie befinden sich in verschiedenen Organen unseres Körpers und durch spezifische Marker, wie Helios und Neuropilin 1 unterschieden werden können. Es wurde berichtet, dass tTreg Zellen funktionell mehr suppressive als pTreg Zellen sind. Daher ist es wichtig, den Anteil der tTreg und pTreg Zellen zu bestimmen, bei der Untersuchung von heterogenen Zellpopulationen. Hier sammelten wir Zebrafischembryonen Drüsen, Pankreas Lymphknoten und Milz von Normoglycemic nicht adipösen diabetischen Mäusen tTreg Zellen aus pTreg Zellen mittels Durchflusszytometrie zu unterscheiden. Wir vorbereitet manuell einzelne Zellsuspensionen von diesen Organen. Fluorochrom konjugiert Oberfläche CD4, CD8, CD25 und Neuropilin-1 Antikörper wurden verwendet, um die Zellen zu beflecken. Sie waren über Nacht im Kühlschrank aufbewahren. Am nächsten Tag waren die Zellen mit intrazellulären Foxp3 und Helios Antikörper konjugiert Fluorochrom befleckt. Diese Markierungen wurden verwendet, um die zwei Teilmengen von Treg-Zellen zu kennzeichnen. Dieses Protokoll zeigt eine einfache aber praktische Möglichkeit, einzelne Zellen von murinen Thymus, Pankreas, Entwässerung, Lymphknoten und Milz vorbereiten und verwenden Sie sie für spätere durchflusszytometrischen Analyse.

Introduction

Regulatorische (Treg) T-Zellen sind entscheidend für die Homöostase des Immunsystems. Treg-Zellen werden durch die Expression von Oberflächenantigenen CD4 und CD25 und die Transkription Faktor Forkhead Box P3 (Foxp3)1,2,3definiert. Sakaguchi Et Al. zeigten erstmals, dass CD25 auf T-Suppressor-Zellen in Mäusen4konstitutiv exprimiert wird, die eine bahnbrechende Beobachtung für die Identifizierung des menschlichen Treg-Zellen zur Verfügung gestellt. Treg-Zellen spielen eine zentrale Rolle im Immuntoleranz durch gleichzeitiges eine unterdrückende Fähigkeit über eine Vielzahl von Mechanismen, einschließlich Zytolyse durch die Sekretion von Granzymen induzieren Apoptose, Zytokin-Verbrauch und Hemmung durch den Ausdruck von zytotoxischen T-Lymphozyten Antigen 45. Darüber hinaus können sie hemmende Zytokine wie z. B. die Umwandlung von Wachstumsfaktor-Beta (TGF-β), Interleukin-10 (IL-10) und IL-355absondern. Treg Zellen natürlich abgeleitet werden aus dem Thymus, in diesem Fall sind sie Zebrafischembryonen abgeleitete Treg (tTreg) Zellen bezeichnet, oder in diesem Fall nennt man peripher induzierte Treg (pTreg) Zellen in den peripheren Organen induziert werden.

Helios, ein Mitglied der Adelsfamilie Ikaros Transkription Faktor wurde berichtet, dass ein Marker für die Unterscheidung zwischen tTreg Zellen und pTreg Zellen6. Zwei andere Gruppen berichtete später, dass Neuropilin 1 (Nrp1), ein semaphorin-III-Rezeptor als Oberfläche Marker für tTreg Zellen unter bestimmten Bedingungen7,8dienen könnte. Dennoch haben Singh Et Al. gezeigt, dass Helios eine bessere Markierung in diesem Zusammenhang in naive Mäuse9.

Die Teilmengen von Treg-Zellen spielen eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase des Immunsystems und den Schutz gegen Autoimmunität und Infektionen. Daher ist es wichtig, die Zahlen und Proportionen dieser Populationen in lymphatischen und nicht-lymphatischen Gewebe zu bestimmen. Um dies zu erreichen, muss man sich einzelne Zellsuspensionen von diesen Organen vorzubereiten. Eine Reihe von Protokollen wurden beschrieben oder in früheren Studien verwendet. Vor allem, wurden automatische Dissociators in zuvor veröffentlichten Berichte10,11verwendet. Mit automatischen Dissociators ist bequem und zeitsparend, aber es ist ein teures Verfahren. Daher haben wir eine manuelle Methode verwendet, um einzelne Zellsuspensionen von murinen Zebrafischembryonen Drüsen, Pankreas Lymphknoten (PDLNs) und Milz von Normoglycemic nicht adipösen Diabetiker (NOD) Mäuse und isolierte Einzelzellen aus diesen Organen vorzubereiten. Mit dieser Methode in unserer früheren Studien und wir fanden, dass die manuelle Methode für die Zubereitung von einzelnen Zellsuspension so effizient wie automatische Dissociator Methode9,12,13,14. Darüber hinaus wir Durchflusszytometrie verwendet, um die Proportionen der CD4 bestimmen+CD8CD25+Foxp3+ Treg Zellen und die Teilmengen von Treg-Zellen tTreg und pTreg Zellen. Die tTreg und pTreg Zellen wurden ausgezeichnet mit Helios und Nrp1 als Marker für tTreg Zelle. So zeigen unsere Ergebnisse, dass die manuelle Methode für die Vorbereitung der einzelnen Zellen effizient funktioniert und vorbereitete Einzelzelle Suspensionen können weiter verwendet werden, für Studien mit Durchflusszytometrie.

Protocol

Die lokalen Tier Ethikkommission an der Universität Uppsala genehmigt die Tierversuche. 1. Ernte Organe von Tieren Die Mäuse durch zervikale Dislokation zu opfern. Zebrafischembryonen Drüsen zu platzieren und Milz in 20 mL funkeln Fläschchen oder 15 mL konische Röhrchen gefüllt mit 5 mL Hanks´ ausgewogenen Salzlösung (HBSS). Ort PDLNs in 1,5 mL Mikro Tuben gefüllt mit 1 mL RPMI 1640. Verwenden Sie die gesamte Thymus und Milz und der PDLNs.Hinweis:</stro…

Representative Results

Um den Ausdruck von Nrp1 und Helios auf tTreg und pTreg Zellen zu untersuchen, wir einzelne Zellen von Zebrafischembryonen Drüsen, PDLNs und Milz Normoglycemic NOD Mäuse vorbereitet und mit der Treg Zelle Marker CD4 und CD25, Foxp3, Helios Nrp1 für Durchfluss durchflusszytometrischen befleckt Analyse. Die Ergebnisse wurden analysiert, wie gezeigt, in der Vertreter gating Strategien (Abbildung 1). Wir fanden, dass den Anteil der Helios+ Zellen un…

Discussion

In dieser Studie wir isolierte Einzelzellen aus Zebrafischembryonen Drüsen, PDLNs und Milz von Mäusen, NICKEN, und untersucht den Ausdruck von Helios und Nrp1 in CD4+CD8CD25+Foxp3+ Treg Zellen mittels Durchflusszytometrie. In der vorliegenden Studie wurden NOD Mäuse verwendet, das heißt ein Mausmodell des Typ 1 Diabetes. In einer früheren Studie haben wir die Wildtyp-Maus-Stämmen CD-1 und C57BL/6 Mäusen verwendet, um zu untersuchen, ob Helios oder Nrp1 eine bessere Ma…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die vorliegende Studie wurde von der schwedischen Forschungsrat, EXODIAB, der schwedischen Diabetes Foundation, schwedische Kind Diabetes Fonds, SEB Diabetesfonden und O.E Och Edla Johanssons Vetenskapliga Stiftelse finanziell unterstützt. Autoren möchten Dank pro-Ola Carlsson und Stellan Sandler für ihre Unterstützung und Diskussionen.

Materials

NOD mice In-house breading
HBSS Statens veterinärmedicinska anstalt 991750
RPMI-1640 Sigma-Aldrich R0883-500ML
NH4Cl EMD Millipore 1011450500
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set ThermoFisher 00-5523-00 Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10X)
eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer ThermoFisher 00-4222-26
CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience ThermoFisher 11-0042-85
CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience ThermoFisher 12-0251-83
BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a BD Biosciences 560182
Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody R&D Systems FAB5994A
FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience ThermoFisher 25-5773-82
Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody BioLegend 137220
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap CORNING 352235 A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap
Tube 15ml, 120x17mm, PP Sarstedt 62.554.002
Micro tube 1.5ml Sarstedt 72.690.001
disposable scintillation vials WHEATON
Flow cytometry BD
Flow cytometry analysis software Inivai Technologies Flowlogic

References

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  2. Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).
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Cite This Article
Luo, Z., Thorvaldson, L., Blixt, M., Singh, K. Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (144), e58848, doi:10.3791/58848 (2019).

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