Calretinin için Immünostasyon rektal emiş biyopsisi ile Hirschsprung hastalığının tanısı, S100 protein ve protein gen ürün 9,5
Summary
Bu protokol, calretinin, S100 proteini ve protein geni ürün 9,5 için immünostasyon rektal emiş biyopsisi sürecini açıklar. Hirschsprung hastalığı için bu roman adjuvan tanı yöntemi tercih duyarlılık ve özgüllük oranları vardır.
Abstract
Hirschsprung hastalığı (HD) klinik olarak bebeklerde mekonyum veya çocuklarda uzun süreli kabızlık geçmek için bir yetersizlik olarak ortaya çıkan konjenital bir bağırsak hastalığıdır. Rektal emiş biyopsisi (RSB) ganglion hücrelerinin yokluğunda belirlemek için ve nöral hipertrofisi Şu anda HD tanısı için en doğru testtir. Geleneksel hematoksislin-eozin boyama hassasiyeti ve özgüllüğü yoktur. Asetilkolinesteraz boyama karmaşık süreci nedeniyle yaygın olarak kullanılamaz. RSBs üzerinde yaptığımız calretinin, S100 proteini ve protein geni ürün 9,5 (PGP 9.5) için immünostasyonu olan yeni protokolümüz,% 96,49 (% 95 güven aralığı, 0.88-0,99) ve% 100 (% 95 güven aralığında) yüksek hassasiyet ve özgüllük oranları sergiler interval, 0.97-1.00), sırasıyla. HD etkilenen segmentler genellikle kalretinin ifadesi yokluğunda mevcut, S100 protein, ve PGP 9.5, submukozal dokuda nöral Hipertrofinin belirteçleri olan. Bu protokol, bu yeni tanılama yönteminin ayrıntılı işletim sürecini açıklar.
Introduction
Hirschsprung hastalığı (HD) distal bağırsak yolunun farklı segmentlerinde ganglion hücrelerinin eksikliği ile karakterize ortak konjenital bağırsak bağırsak bozukluğu1. Embriyonik nöral hücrelerin istilası tamamlandığında insan enterik sinir sistemi oluşur. Eğer sürecin bir bozukluğu varsa ve istilanın tamamlanması başarısız olursa, yenidoğan distal bağırsak aganglionik2olur. Bu potansiyel ölümcül durum Hirschsprung hastalığı denir. Proliferasyon, motilite ve bağırsak büyümesi başarılı kolonizasyon üç ana bileşenleridir.
Sınırlı submukozal biyopsinin geleneksel hematoksisi ve Eozinin (H & E) boya tedavisi, ameliyattan elde edilen tam kalınlıkta bir dokunun H & E boyama sonucu tatmin edici olarak elde edilemez. Ayrıca, rektal emiş dokusunun asetilkolinesteraz (AChE) lekesi,% 91 olan yetersiz duyarlılığı ve Frozen bölümler3,4‘ ün karmaşık işlenmesi nedeniyle teorik olarak zordur. Ganglion hücrelerinin ve formalin-sabit ve parafin-gömülü örneklerinde lekelenebilir sinir liflerinin birçok diğer immunhistokimyasal belirteçleri kademeli olarak mainstream HD tanılama haline gelmektedir. Calretinin, HD etkilenen segmentlerin myenterik ve submukozal pleksusunda ifade edilmez olan D vitamini bağımlı kalsiyum bağlayıcı bir proteindir5. , Sinir lifleri ve glial hücreler, genellikle HD etkilenen segmentler6submukozal dokuda nöro hipertrofisi mevcut gibi neural arması türetilen hücrelerde S100 protein ifade edilir. Protein gen ürün 9,5 (PGP 9.5) güvenilir lekeler sinir lifleri ve ganglion hücreleri; PGP 9.5 boyama, özellikle izole hypoganglionosis vakalarında, kalretinin lekeleme ek olarak davranır. S100 ve PGP 9.5 ile çift boyama yanlış negatif hızını azaltabilir ve hassasiyeti artırabilir. Bir önkoşul olarak, mevcut çalışma bu roman tanı yönteminin yeterli özgüllüğü ve yüksek hassasiyetini sağlamayı amaçlamaktadır. Bizim yeni protokol aganglionik bağırsak ve hipertrofik sinir lifleri ayrımcılık için her üç işaretçileri kullandı. 318 çocuk prospektif bir çalışma laboratuvarımız tarafından yapıldı ve daha önce ayrıntılı bir protokol7olmadan yayınlandı. Bu makalede ayrıntılı protokol ve önlemler ele alınmaktadır. Doğumdan bu yana şiddetli bir defekasyon probleminden ya da diğer ortak hastalıklar haricinde kronik kabızlık olan çocuklardan gelen herhangi bir yenidoğan, rektal emiş biyopsisi (RSB) için potansiyel adaylardır. Bizim yeni protokol sadece RSBs değil, aynı zamanda tam kalınlık biopsleri veya cerrahi numuneler son tanı yapmak için boyama için uygundur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada HD tanısı için RBS bölümlerini lekelemek için üç farklı immunhistokimyasal antikorları kullanarak bir prosedür açıklanmıştır. Tanı protokollerimizin duyarlılığı% 96,49 (% 95 CI, 0.88-0,99) ve özgüllük% 100 (% 95 0.97-1.00) oldu.
Protokolün en önemli adımları RSB ve antijen-antikorların reaksiyonu. Biyopsinin büyüklüğü, lekeme doğruluğunu belirler. Küçük bir biyopsi hassas bir tanı yapmak için yeterli doku sağlamaz, büyük bir biyopsi ise daha y…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Film Laboratuvarı sağlayan onun büyük yardım için Tang weibing teşekkür ederiz. Bu yazı kamu refah araştırma tarafından desteklenmektedir ve özel fonlar Çin Ulusal Sağlık ve aile planlaması (Grant No. 201402007) alındı.
Materials
| calretinin antibody | MXB Biotechnologies | MAB-0716 170416405c | antibody: primary antibody |
| S-100 antibody | MXB Biotechnologies | Kit-0007 | antibody: primary antibody |
| PGP9.5 antibody | Shanghai long island antibody Co. Ltd | R-0457-03 | antibody: primary antibody |
| enhancer reagent | MXB Biotechnologies | KIT-9902-A 170416405a | antibody: secondary antibody A |
| Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody | MXB Biotechnologies | KIT-9902-B | antibody: secondary antibody B |
| DAB staining kit (containing reagent A B and C) | MXB Biotechnologies | DAB-0031 | staining kit |
| Heat incubator | Shanghai yiheng instrument Co. Ltd | DHP-9082 | instrument |
| Rbi2 suction rectal biopsy system | Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia | CP1200 HP1000 SS1000 | instrument |
| microtome | Leica | leica RM2016 | instrument |
| citric acid sodium citrate buffer(100X) | MXB Biotechnologies | MVS-0101 | antigen retrieval buffer |
| pathological tissue dehydrator | wuhan junjie electronic Co. Ltd | JT-12F | instrument |
References
- Tam, P. K. Hirschsprung’s disease: A bridge for science and surgery. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).
- Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung’s disease: advances in genetic and stem cell studies. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 466-479 (2007).
- Setiadi, J. A., Dwihantoro, A., Iskandar, K., Heriyanto, D. S., Gunadi, The utility of the hematoxylin and eosin staining in patients with suspected Hirschsprung disease. BMC Surgery. 17 (1), 71 (2017).
- Agrawal, R. K., et al. Acetylcholinesterase histochemistry (AChE) – A helpful technique in the diagnosis and in aiding the operative procedures of Hirschsprung disease. Diagnostic Pathology. 10 (1), 208 (2015).
- Kacar, A., Arikok, A. T., Azili, M. N., Ekberli Agirbas, G., Tiryaki, T. Calretinin immunohistochemistry in Hirschsprung’s disease: An adjunct to formalin-based diagnosis. The Turkish Journal of Gastroenterology. 23 (3), 226-233 (2012).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Jiang, M., et al. S100 and protein gene product 9.5 immunostaining of rectal suction biopsies in the diagnosis of Hirschsprung’ disease. American Journal of Translational Research. 8 (7), 3159 (2016).
- Takawira, C., D’Agostini, S., Shenouda, S., Persad, R., Sergi, C. Laboratory procedures update on Hirschsprung disease. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. 60 (5), 598 (2015).
- Meier-Ruge, W., et al. Acetylcholinesterase activity in suction biopsies of the rectum in the diagnosis of Hirschsprung’s disease. Journal of Pediatric Surgery. 7 (1), 11-17 (1972).
- Barshack, I., Fridman, E., Goldberg, I., Chowers, Y., Kopolovic, J. The loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung’s disease. Journal of Clinical Pathology. 57 (7), 712-716 (2004).
- Kapur, R. P. Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease. American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).
- Guinardsamuel, V., et al. Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease. Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).
- Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung’s disease. Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).
- Monforte-Muñoz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. H. Increased submucosal nerve trunk caliber in aganglionosis: a "positive" and objective finding in suction biopsies and segmental resections in Hirschsprung’s disease. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 122 (8), 721-725 (1998).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Sams, V. R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung’s disease. Journal of Pathology. 168 (1), 55 (1992).
- Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis. International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303 (2011).
