Diagnose der Hirschsprung-Krankheit durch die Immunofelflecken-Rectal Suction Biopsien für Calretinin, S100 Protein und Protein Gene Produkt 9.5
Summary
Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Immunfärbung von rektalen Absaugbiopsien für Calretinin, S100-Protein und Protein-Genprodukt 9.5. Diese neuartige Adjuvan-Diagnostik für Hirschsprungs Krankheit hat bevorzugt Empfindlichkeits-und Spezifitätsraten.
Abstract
Hirschsprungs Krankheit (HD) ist eine angeborene Darmerkrankung, die sich klinisch als Unfähigkeit manifestiert, Mekonium bei Säuglingen oder als langfristige Verstopfung bei Kindern zu passieren. Die Rectal-Saugbiopsie (RSB) zur Bestimmung des Fehlens von Ganglienzellen und der neuronalen Hypertrophie ist derzeit der genaueste Test für die Diagnose von HD. Der traditionellen Hämatoxlin-Eosin-Färbung fehlt es an Sensibilität und Spezifität. Die Acetylcholinesterase-Färbung kann aufgrund ihres komplexen Prozesses nicht weit verbreitet sein. Unser neuartiges Protokoll der Immunfärbung für Kalretinin, S100-Protein und Protein-Genprodukt 9.5 (PGP9.5), das wir an RSBs durchgeführt haben, weist hohe Empfindlichkeits-und Spezifitätsraten von 96,49% (95% Vertrauensintervall, 0,88-0,99) und 100% (95% Zuversicht auf Intervall, 0,97-1.00), bzw. Die HD-betroffenen Segmente treten oft als das Fehlen des Ausdrucks von Calretin, S100-Protein und PGP9.5 auf, die Marker der neuronalen Hypertrophie im submukosmischen Gewebe sind. Dieses Protokoll beschreibt den detaillierten Arbeitsprozess dieser neuen Diagnosemethode.
Introduction
Hirschsprungs Erkrankung (HD) ist eine häufige angeborene Darmdarmstörung, die durch einen Mangel an Ganglienzellen in verschiedenen Segmenten des distalenDarms 1 gekennzeichnet ist. Das menschliche, enterische Nervensystem entsteht, wenn die Invasion der embryonalen Zellen abgeschlossen ist. Wenn es eine Störung des Prozesses gibt und die Invasion nicht abgeschlossen ist, wird der Distanzdarm des Neugeborenen aganglionisch2. Dieser potenziell tödliche Zustand wird Hirschsprungs Krankheit genannt. Verbreitung, Beweglichkeit und Darmwachstum sind die drei Hauptbestandteile einer erfolgreichen Kolonisierung.
Die traditionelle Hämatoxylin und Eosin (H & E) kann eine begrenzte submukosmale Biopsie nicht so zufriedenstellend erreichen wie die H-& E-Färbung eines aus der Operation gewonnenen Volldickengewebes. Darüber hinaus ist die Acetylcholinesterase (AChE) Färbung des rektalen Sauggewebes theoretisch eine Herausforderung, da die Empfindlichkeit von 91% nicht ausreichend ist, unddie komplexe Verarbeitung der gefrorenen Abschnitte3,4. Mehrere andere immunhistochemische Marker von Ganglienzellen und Nervenfasern, die in formalinfixierten und paraffin-eingebetteten Proben verfärbt werden können, werden nach und nach zur Mainstream-HD-Diagnostik. Calretinin ist ein Vitamin D-abhängiges Kalziumbindenprotein, das sich nicht im myenterischen und submukosmischen Plexus von HD-betroffenenSegmenten 5 ausdrückt. S100-Protein wird in Zellen ausgedrückt, die aus dem neuronalen Kamm abgeleitet werden, wie Nervenfasern und Gliazellen, die im Submukosmonalgewebe der HD-betroffenenSegmente 6 oft neuronale Hypertrophie aufweisen. Protein-Gen-Produkt 9.5 (PGP9.5) verfärbt zuverlässig Nervenfasern und Ganglienzellen; Die PGP9.5-Färbung dient als Ergänzung zur Kalretinin-Färbung, insbesondere bei isolierter Hypoganglionose. Doppelfärbung mit S100 und PGP9.5 kann die Falsch-Negativrate senken und die Empfindlichkeit erhöhen. Als Voraussetzung ist, dass die aktuelle Studie eine ausreichende Spezifität und hohe Empfindlichkeit dieser neuartigen Diagnostik gewährleisten soll. Unser neuartiges Protokoll verwendete alle drei Marker für die Diskriminierung von aganglionischen Darm und hypertrophen Nervenfasern. Eine prospektive Studie mit 318 Kindern wurde von unserem Labor durchgeführt und zuvor ohne ein detailliertes Protokoll7veröffentlicht. Das detaillierte Protokoll und die Vorsichtsmaßnahmen werden in diesem Artikel diskutiert. Alle Neugeborenen, die seit der Geburt an einem schweren Defekationsproblem litten, oder Kinder mit chronischer Verstopfung, die andere Volkskrankheiten ausgrenzend ausgrenzten, sind potenzielle Kandidaten für die rektale Saugbiopsie (RSB). Unser neuartiges Protokoll eignet sich zur Färbung nicht nur von RSBs, sondern auch zur Färbung von Biopsien oder chirurgischen Proben, um eine endgültige Diagnose zu stellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrieben wir ein Verfahren mit drei verschiedenen immunhistochemischen Antikörpern, um RBS-Abschnitte für die Diagnose von HD zu verfärben. Die Empfindlichkeit unseres Diagnoseprotokolls betrug 96,49% (95% CI, 0,88-0,99), und die Spezifität lag bei 100% (95% CI, 0,97-1,00).
Die kritischsten Schritte des Protokolls sind die RSB-und Antigen-Antikörper-Reaktion. Die Größe der Biopsie bestimmt die Genauigkeit der Färbung. Eine kleine Biopsie liefert nicht genügend Gewebe, um eine …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Weibing Tang für seine große Hilfe bei der Bereitstellung des Drehortes. Dieser Artikel wird von der Public Welfare Research unterstützt, und Sonderfonds wurden von der National Health and Family Planning of China (Grant No.201402007) erhalten.
Materials
| calretinin antibody | MXB Biotechnologies | MAB-0716 170416405c | antibody: primary antibody |
| S-100 antibody | MXB Biotechnologies | Kit-0007 | antibody: primary antibody |
| PGP9.5 antibody | Shanghai long island antibody Co. Ltd | R-0457-03 | antibody: primary antibody |
| enhancer reagent | MXB Biotechnologies | KIT-9902-A 170416405a | antibody: secondary antibody A |
| Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody | MXB Biotechnologies | KIT-9902-B | antibody: secondary antibody B |
| DAB staining kit (containing reagent A B and C) | MXB Biotechnologies | DAB-0031 | staining kit |
| Heat incubator | Shanghai yiheng instrument Co. Ltd | DHP-9082 | instrument |
| Rbi2 suction rectal biopsy system | Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia | CP1200 HP1000 SS1000 | instrument |
| microtome | Leica | leica RM2016 | instrument |
| citric acid sodium citrate buffer(100X) | MXB Biotechnologies | MVS-0101 | antigen retrieval buffer |
| pathological tissue dehydrator | wuhan junjie electronic Co. Ltd | JT-12F | instrument |
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