تشخيص مرض هيرشسبرونغ من خلال الخزعات شفط المستقيم المناعي لكالريتينين ، S100 البروتين والبروتين الجينات المنتج 9.5
Summary
يصف هذا البروتوكول عمليه الخزعات شفط المستقيم المناعي لكالريتينين ، S100 البروتين ، والبروتين المنتج الجينات 9.5. هذه الطريقة التشخيصية المساعد الرواية لمرض هيرشسبرونغ لديها حساسية المفضلة ومعدلات الخصوصية.
Abstract
مرض هيرشسبرونغ (HD) هو مرض معوي خلقي يتجلى سريريا كعدم قدره علي اجتياز المينيوم عند الرضع أو كامساك طويل الأجل عند الأطفال. خزعة شفط المستقيم (RSB) لتحديد عدم وجود خلايا العقدة وتضخم العصبية هو الاختبار الأكثر دقه لتشخيص HD في الوقت الحاضر. تلطيخ الهييوكسيلين التقليدية-ايوسين يفتقر إلى الحساسية والخصوصية. لا يمكن استخدامها علي نطاق واسع لتلطيخ استيل بسبب عمليه معقده. لدينا بروتوكول رواية من المناعي لكالريتينين ، S100 البروتين ، والبروتين الجينات المنتج 9.5 (PGP 9.5) ، والتي أجريناها علي RSBs ، معارض عاليه الحساسية ومعدلات الخصوصية من 96.49 ٪ (95 ٪ فاصل الثقة ، 0.88-0.99) و 100 ٪ (95 ٪ الثقة الفاصل الزمني ، 0.97-1.00) ، علي التوالي. الشرائح HD المتضررة غالبا ما تكون موجودة كغياب للتعبير عن كالريتينين, S100 البروتين, و PGP 9.5, وهي علامات لتضخم العصبية في الانسجه تحت المخاطية. يصف هذا البروتوكول عمليه التشغيل التفصيلية لطريقه التشخيص الجديدة هذه.
Introduction
مرض هيرشسبرونغ (HD) هو اضطراب الأمعاء المعوية الخلقية الشائعة التي تتميز بعدم وجود خلايا العقدة في أجزاء مختلفه من الأمعاء البعيدة1. يتم تشكيل الجهاز العصبي المعوي البشري عندما يتم الانتهاء من غزو الخلايا العصبية الجنينية. إذا كان هناك اضطراب في العملية وفشل الغزو لإكمال ، والأمعاء البعيدة من الوليد يصبح عقد2. وتسمي هذه الحالة المميتة المحتملة بمرض هيرشسبرونغ. ان الانتشار والحركية ونمو الأمعاء هي المكونات الثلاثة الرئيسية للاستعمار الناجح.
التقليدية الهيسوكسيلين و ايوسين (H & E) تلطيخ من خزعة تحت المخاطية محدوده لا يمكن ان تصل إلى مرضيه من نتيجة كما H & E تلطيخ من نسيج كامل السماكة التي تم الحصول عليها من الجراحة. بالاضافه إلى ذلك ، استيل (وجع) تلطيخ انسجه شفط المستقيم من الصعب نظريا نظرا لحساسيته غير كافيه ، وهو 91 ٪ ، ومعالجه معقده من الأقسام المجمدة3،4. عده علامات مناعي أخرى من الخلايا العقديه وألياف العصبية التي يمكن ان تكون ملطخه في formalin-الثابتة والعينات المضمنة البارافين تصبح تدريجيا التشخيص هد السائد. كالريتينين هو بروتين ملزم بفيتامين د يعتمد علي الكالسيوم ولا يتم التعبير عنه في الضفيرة المعوية وشبه المخاطية للأجزاء المصابة بالدقة العالية5. يتم التعبير عن البروتين S100 في الخلايا المستمدة من القمه العصبية ، مثل ألياف العصبية والخلايا الدليج ، والتي غالبا ما تقدم تضخم العصبية في الانسجه تحت المخاطية من الشرائح HD المتضررة6. بروتين الجينات المنتج 9.5 (PGP 9.5) البقع بشكل موثوق ألياف العصبية والخلايا العقديه. PGP 9.5 تلطيخ بمثابه تكمله لتلطيخ كالريتينين ، وخصوصا في حالات معزولة هيبوجانجيوسيس. تلطيخ مزدوجة مع S100 و PGP 9.5 يمكن ان تقلل من معدل كاذبه سالبه وزيادة الحساسية. وكشرط أساسي ، تهدف الدراسة الحالية إلى ضمان الخصوصية الكافية والحساسية العالية لهذه الطريقة التشخيصية الجديدة. استخدم بروتوكولنا الجديد جميع العلامات الثلاثة للتمييز بين الأمعاء الغليظة وألياف العصبية المفرطة. وقد اجري مختبرنا دراسة مرتقبه ل318 طفلا ونشرت سابقا بدون بروتوكول مفصل7. يتم مناقشه البروتوكول المفصل والاحتياطات في هذه المقالة. اي الولدان الذين يعانون من مشكله التغوط الشديد منذ الولادة أو الأطفال المصابين بالإمساك المزمن باستثناء الامراض الشائعة الأخرى هي المرشحين المحتملين لخزعة شفط المستقيم (RSB). لدينا بروتوكول رواية مناسبه لتلطيخ ليس فقط RSBs ولكن أيضا كامل سمك الخزعات أو العينات الجراحية لاجراء التشخيص النهائي.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا وصفنا اجراء باستخدام ثلاثه أجسام مضاده مناعي مختلفه لوصمه عار أقسام RBS لتشخيص هد. وكانت حساسية بروتوكول التشخيص لدينا 96.49 ٪ (95 ٪ CI ، 0.88-0.99) ، وكانت الخصوصية 100 ٪ (95 ٪ CI ، 0.97-1.00).
الخطوات الأكثر اهميه في البروتوكول هي RSB ورد فعل مستضد الأجسام المضادة. يحدد حجم الخزعة دقه التلطيخ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر المؤلفون وييبينغ تانغ علي مساعدته الكبيرة في توفير مختبر التصوير. وهذه المادة مدعومة ببحوث الرفاه العام ، ووردت أموال خاصه من الصحة الوطنية وتنظيم الاسره في الصين (المنحة رقم 201402007).
Materials
| calretinin antibody | MXB Biotechnologies | MAB-0716 170416405c | antibody: primary antibody |
| S-100 antibody | MXB Biotechnologies | Kit-0007 | antibody: primary antibody |
| PGP9.5 antibody | Shanghai long island antibody Co. Ltd | R-0457-03 | antibody: primary antibody |
| enhancer reagent | MXB Biotechnologies | KIT-9902-A 170416405a | antibody: secondary antibody A |
| Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody | MXB Biotechnologies | KIT-9902-B | antibody: secondary antibody B |
| DAB staining kit (containing reagent A B and C) | MXB Biotechnologies | DAB-0031 | staining kit |
| Heat incubator | Shanghai yiheng instrument Co. Ltd | DHP-9082 | instrument |
| Rbi2 suction rectal biopsy system | Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia | CP1200 HP1000 SS1000 | instrument |
| microtome | Leica | leica RM2016 | instrument |
| citric acid sodium citrate buffer(100X) | MXB Biotechnologies | MVS-0101 | antigen retrieval buffer |
| pathological tissue dehydrator | wuhan junjie electronic Co. Ltd | JT-12F | instrument |
References
- Tam, P. K. Hirschsprung’s disease: A bridge for science and surgery. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).
- Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung’s disease: advances in genetic and stem cell studies. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 466-479 (2007).
- Setiadi, J. A., Dwihantoro, A., Iskandar, K., Heriyanto, D. S., Gunadi, The utility of the hematoxylin and eosin staining in patients with suspected Hirschsprung disease. BMC Surgery. 17 (1), 71 (2017).
- Agrawal, R. K., et al. Acetylcholinesterase histochemistry (AChE) – A helpful technique in the diagnosis and in aiding the operative procedures of Hirschsprung disease. Diagnostic Pathology. 10 (1), 208 (2015).
- Kacar, A., Arikok, A. T., Azili, M. N., Ekberli Agirbas, G., Tiryaki, T. Calretinin immunohistochemistry in Hirschsprung’s disease: An adjunct to formalin-based diagnosis. The Turkish Journal of Gastroenterology. 23 (3), 226-233 (2012).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Jiang, M., et al. S100 and protein gene product 9.5 immunostaining of rectal suction biopsies in the diagnosis of Hirschsprung’ disease. American Journal of Translational Research. 8 (7), 3159 (2016).
- Takawira, C., D’Agostini, S., Shenouda, S., Persad, R., Sergi, C. Laboratory procedures update on Hirschsprung disease. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. 60 (5), 598 (2015).
- Meier-Ruge, W., et al. Acetylcholinesterase activity in suction biopsies of the rectum in the diagnosis of Hirschsprung’s disease. Journal of Pediatric Surgery. 7 (1), 11-17 (1972).
- Barshack, I., Fridman, E., Goldberg, I., Chowers, Y., Kopolovic, J. The loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung’s disease. Journal of Clinical Pathology. 57 (7), 712-716 (2004).
- Kapur, R. P. Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease. American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).
- Guinardsamuel, V., et al. Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease. Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).
- Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung’s disease. Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).
- Monforte-Muñoz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. H. Increased submucosal nerve trunk caliber in aganglionosis: a "positive" and objective finding in suction biopsies and segmental resections in Hirschsprung’s disease. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 122 (8), 721-725 (1998).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Sams, V. R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung’s disease. Journal of Pathology. 168 (1), 55 (1992).
- Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis. International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303 (2011).
