Diagnose van de ziekte van Hirschsprung door immunokleuring rectale zuig biopten voor Calretinin, S100 proteïne en eiwit gen product 9,5
Summary
Dit protocol beschrijft het proces van immunokleuring rectale zuig biopten voor calretinin, S100 proteïne, en proteïne gen product 9,5. Deze nieuwe adjuvante diagnostische methode voor de ziekte van Hirschsprung heeft de voorkeur gevoeligheid en specificiteit tarieven.
Abstract
De ziekte van Hirschsprung (HD) is een aangeboren darmziekte die klinisch manifesteert zich als een onvermogen om meconium door te geven bij zuigelingen of als langdurige constipatie bij kinderen. Rectale zuig biopsie (RSB) om de afwezigheid van ganglioncellen en neurale hypertrofie te bepalen is de meest accurate test voor de diagnose van HD op dit moment. Traditionele hematoxyline-eosine kleuring ontbreekt gevoeligheid en specificiteit. Acetylcholinesterase kleuring kan niet op grote schaal worden gebruikt vanwege zijn complexe proces. Onze nieuwe protocol van immunokleuring voor calretinin, S100 Protein, en Protein Gene product 9,5 (PGP 9.5), die we uitgevoerd op RSBs, vertoont hoge gevoeligheid en specificiteit van 96,49% (95% betrouwbaarheidsinterval, 0.88-0.99) en 100% (95% vertrouwen interval, 0.97-1.00), respectievelijk. De HD-getroffen segmenten vaak aanwezig als de afwezigheid van de expressie van calretinin, S100 Protein, en PGP 9.5, die markers van neurale hypertrofie in de submucosale weefsel. Dit protocol beschrijft het gedetailleerde werkproces van deze nieuwe diagnostische methode.
Introduction
De ziekte van Hirschsprung (HD) is een gemeenschappelijke aangeboren darm darmaandoening die wordt gekenmerkt door een gebrek aan ganglioncellen in verschillende segmenten van het distale darmkanaal1. De menselijke enterische zenuwstelsel wordt gevormd wanneer de invasie van de embryonale neurale cellen is voltooid. Als er een storing van het proces is en de invasie niet voltooit, wordt de distale darm van pasgeboren aganglionic2. Deze potentieel fatale aandoening heet de ziekte van Hirschsprung. Proliferatie, beweeglijkheid, en darm groei zijn de drie belangrijkste componenten van succesvolle kolonisatie.
Traditionele hematoxyline en eosine (H & E) kleuring van een beperkte submucosale biopsie kan niet bereiken als bevredigend van een resultaat als H & E kleuring van een full-dikte weefsel verkregen uit een operatie. Bovendien, acetylcholinesterase (pijn) kleuring van rectale zuig weefsel is theoretisch uitdagende vanwege de onvoldoende gevoeligheid, die is 91%, en complexe verwerking van bevroren secties3,4. Verschillende andere immunohistochemische markers van ganglioncellen en zenuwvezels die kunnen worden gekleurd in formaline-vaste en paraffine-embedded specimens zijn geleidelijk aan steeds de mainstream HD diagnostiek. Calretinin is een vitamine D-afhankelijke calcium-bindende eiwit dat niet wordt uitgedrukt in de myenteric en submucosale plexus van HD-getroffen segmenten5. S100 eiwit wordt uitgedrukt in cellen afgeleid van de neurale kuif, zoals zenuwvezels en glial cellen, die vaak aanwezig neurale hypertrofie in de submucosale weefsel van HD-getroffen segmenten6. Proteïne gen product 9,5 (PGP 9.5) betrouwbare vlekken zenuwvezels en ganglioncellen; PGP 9.5 kleuring fungeert als een aanvulling op calretinin kleuring, vooral in geval van geïsoleerde hypoganglionosis. De dubbele kleuring met S100 en PGP 9.5 kan het vals-negatieve tarief verminderen en de gevoeligheid verhogen. Als voorwaarde, de huidige studie is gericht op een adequate specificiteit en hoge gevoeligheid van deze nieuwe diagnostische methode te waarborgen. Onze nieuwe protocol gebruikt alle drie de markers voor de discriminatie van aganglionic darm en hypertrofische zenuwvezels. Een prospectieve studie van 318 kinderen werd uitgevoerd door ons lab en eerder gepubliceerd zonder een gedetailleerd protocol7. Het gedetailleerde protocol en de voorzorgsmaatregelen worden besproken in dit artikel. Elke pasgeborenen die leed aan een ernstige ontlasting probleem sinds de geboorte of kinderen met chronische constipatie met uitzondering van andere gemeenschappelijke ziekten zijn potentiële kandidaten voor rectale zuig biopsie (RSB). Onze nieuwe protocol is geschikt voor het bevlekken van niet alleen RSBs, maar ook full-dikte biopten of chirurgische specimens om een definitieve diagnose te stellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier hebben we beschreven een procedure met behulp van drie verschillende immunohistochemische antistoffen aan RBS secties vlek voor de diagnose van HD. De gevoeligheid van ons diagnostisch protocol was 96,49% (95% CI, 0.88-0.99), en de specificiteit was 100% (95% CI, 0.97-1.00).
De meest kritieke stappen van het protocol zijn RSB en antigeen-antilichaam reactie. De grootte van de biopsie bepaalt de nauwkeurigheid van de kleuring. Een kleine biopsie zal niet genoeg weefsel om een precieze diag…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Weibing Tang voor zijn grote hulp bij het verstrekken van de filmen Lab. Dit artikel wordt gesteund door het openbare welzijns onderzoek, en de speciale fondsen werden ontvangen van de nationale gezondheid en de familie planning van China (toelage nr. 201402007).
Materials
| calretinin antibody | MXB Biotechnologies | MAB-0716 170416405c | antibody: primary antibody |
| S-100 antibody | MXB Biotechnologies | Kit-0007 | antibody: primary antibody |
| PGP9.5 antibody | Shanghai long island antibody Co. Ltd | R-0457-03 | antibody: primary antibody |
| enhancer reagent | MXB Biotechnologies | KIT-9902-A 170416405a | antibody: secondary antibody A |
| Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody | MXB Biotechnologies | KIT-9902-B | antibody: secondary antibody B |
| DAB staining kit (containing reagent A B and C) | MXB Biotechnologies | DAB-0031 | staining kit |
| Heat incubator | Shanghai yiheng instrument Co. Ltd | DHP-9082 | instrument |
| Rbi2 suction rectal biopsy system | Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia | CP1200 HP1000 SS1000 | instrument |
| microtome | Leica | leica RM2016 | instrument |
| citric acid sodium citrate buffer(100X) | MXB Biotechnologies | MVS-0101 | antigen retrieval buffer |
| pathological tissue dehydrator | wuhan junjie electronic Co. Ltd | JT-12F | instrument |
References
- Tam, P. K. Hirschsprung’s disease: A bridge for science and surgery. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).
- Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung’s disease: advances in genetic and stem cell studies. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 466-479 (2007).
- Setiadi, J. A., Dwihantoro, A., Iskandar, K., Heriyanto, D. S., Gunadi, The utility of the hematoxylin and eosin staining in patients with suspected Hirschsprung disease. BMC Surgery. 17 (1), 71 (2017).
- Agrawal, R. K., et al. Acetylcholinesterase histochemistry (AChE) – A helpful technique in the diagnosis and in aiding the operative procedures of Hirschsprung disease. Diagnostic Pathology. 10 (1), 208 (2015).
- Kacar, A., Arikok, A. T., Azili, M. N., Ekberli Agirbas, G., Tiryaki, T. Calretinin immunohistochemistry in Hirschsprung’s disease: An adjunct to formalin-based diagnosis. The Turkish Journal of Gastroenterology. 23 (3), 226-233 (2012).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Jiang, M., et al. S100 and protein gene product 9.5 immunostaining of rectal suction biopsies in the diagnosis of Hirschsprung’ disease. American Journal of Translational Research. 8 (7), 3159 (2016).
- Takawira, C., D’Agostini, S., Shenouda, S., Persad, R., Sergi, C. Laboratory procedures update on Hirschsprung disease. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. 60 (5), 598 (2015).
- Meier-Ruge, W., et al. Acetylcholinesterase activity in suction biopsies of the rectum in the diagnosis of Hirschsprung’s disease. Journal of Pediatric Surgery. 7 (1), 11-17 (1972).
- Barshack, I., Fridman, E., Goldberg, I., Chowers, Y., Kopolovic, J. The loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung’s disease. Journal of Clinical Pathology. 57 (7), 712-716 (2004).
- Kapur, R. P. Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease. American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).
- Guinardsamuel, V., et al. Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease. Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).
- Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung’s disease. Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).
- Monforte-Muñoz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. H. Increased submucosal nerve trunk caliber in aganglionosis: a "positive" and objective finding in suction biopsies and segmental resections in Hirschsprung’s disease. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 122 (8), 721-725 (1998).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Sams, V. R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung’s disease. Journal of Pathology. 168 (1), 55 (1992).
- Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis. International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303 (2011).
