Bakteriyel Pathogen sonda için hücresel ve Organismic düzeyi ana bilgisayar yanıt için kullanma
Summary
Biz faktörler ana bilgisayar kodlama faaliyetlerini analiz için kullanılan her iki tüp bebek ve içinde vivo enfeksiyonu deneyleri tarif.
Abstract
Hayatta kalmak için ve bir kez ökaryotik hücre içinde prolifere bakteriyel patojenler istihdam stratejileri çeşitli vardır. Sözde ‘sitozolik’ patojenler (Listeria Monositogenez, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, FRANCISELLA tularensisve Rickettsia’nin spp.) tarafından enfekte hücre sitozol erişim fiziksel ve enzimatik birincil vacuolar membran aşağılayıcı. Bir kez sitozol Bu patojenler hem çoğalırlar yanı sıra yeni hücre bulaştırmak için ana hücresinin plazma zarı nüfuz için yeterli mekanik Kuvvetleri oluşturmak. İşte, L. Monositogenez (Lm) hücresel enfeksiyon döngüsünün terminal bu adımı koloni oluşturan birim testleri ve Akış Sitometresi tarafından sayısal ve nasıl her iki patojen ve ev sahibi olarak kodlanmış faktörler etkisi örnekleri bu vermek nasıl göstermektedir işlem. Ayrıca yakın bir ilişkiyi Lm enfeksiyon dinamikler kültürlü hücre tüp bebek bulaşmış ve bu fareler türetilmiş karaciğer hücrelerinin enfekte içinde vivo gösteriyoruz. Bu işlev tabanlı deneyleri oldukça basit ve kolayca keşif dayalı yüksek üretilen iş ekranlar için modülatörler ökaryotik hücre işlevinin için ölçeklendirilebilir.
Introduction
Enfeksiyon tabanlı deneysel modeller bağımlılığını başlangıç durumu koşullar ev sahibi ve patojen, çeşitli patojen bulaşma stratejileri ve patojen ve ana bilgisayar kullanan işlemler atfederek zorluğu nedeniyle doğal olarak zor olan bağlı olarak sonuçlar. Listeria Monositogenez (Lm) bakteri konak savunma yanıt-e doğru onun genetik ve mikrobiyolojik tractability, hızlı ve ilerleyicidir hücresel enfeksiyonu stratejisini ve nispeten açık nedeniyle soruşturma için ideal bir patojen haline gelmiştir onun cep-organismic düzeyi ve enfeksiyon fenotipleri arasındaki ilişki. Lm hücresel enfeksiyon dört ayrı aşama1ile devam eder: (i) içinde bir çarpıtma; kapalı Lm ile adl hücresel Invasion (II) Lm-yönetmen çarpıtması membran dağılması ve Lm yayın içine sitozol; (III) intracytosolic yineleme; ve her iki bitişik hücreleri (olduğu gibi bir epitel sayfası gibi) enfeksiyon veya soliter hücrelerdeki sonuçları plazma zarı Lm sürümü ekstraselüler ortamın içine (IV) fiziksel nüfuz. Her bu aşamalardan belirli Lmtarafından terfi-kodlanmış faktörler (‘virülans faktörleri’ anılacaktır), silindiğinde, hücresel ve hayvan modellerinde enfeksiyon kusurları neden. Bu genel enfeksiyon strateji sözde ‘sitozolik’ patojenler2bir dizi tarafından bağımsız olarak gelişmiştir.
Koloni oluşturan birim (CFU) deneyleri yaygın olarak tüp bebek her ikisi de değerlendirmek için istihdam (yani, hücresel) olarak içinde vivo de (örneğin, organismic) enfeksiyon sonuçları. Ek olarak içinde vivo enfeksiyonlar, özellikle için onların yüksek hassasiyet patojen işgali ve hücre içi hayatta kalma/yayılması için net bir okuma CFU deneyleri sağlar. CFU deneyleri kapsamlı enfeksiyon etkisi Lm ve konak hücre belirleyicileri analiz etmek için kullanılmaktadır. Bu önceki çalışmalarda hücresel istilası ve intracytosolic çoğaltma çözümlemek için olduğu gibi bilgilendirici, CFU deneyleri bilgimizi, en iyi şekilde Lm enfeksiyon işleminin dördüncü aşamasını izlemek için kullanılmayan,: hücresel kaçış. Burada, biz (bundan böyle ‘olarak ortaya çıkması’ denir) nasıl hücresel kaçmanın bir yolu CFU tahlil (yanı sıra Akış Sitometresi) izlenebilir ve Lm bu aşaması nasıl her iki patojen ve ev sahibi olarak kodlanmış faktörler örnekleri gösteri düzenleyen nispeten basit tarif enfeksiyon döngüsü. Hücresel Lm enfeksiyon döngüsü terminal aşamasının analiz ek patojen ve konak hücre enfeksiyon özgü faktörler ve aktiviteleri tanımlama mümkün yapabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Onun hızlı ve ilerleyicidir hücresel enfeksiyonu nedeniyle, Lm enfeksiyon etkisi hücresel aktiviteler soruşturma için ideal bir patojen bir programdır. Ana faktörlerin bir Lm hücresel enfeksiyon11,12,13,14olumlu veya olumsuz yönde etkileyen tespit edilmiştir. İki tür ev sahipliği bizim laboratuvar Perforin-2 ve Heme düzenlenir inhibitörü ile karakterize faktö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads | Life Technologies | A10346 | |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | EMD Milipore | 110493 | |
| Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| DMEM media | Gibco | 11965-092 | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| FBS – Heat Inactivated | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648-6X500ML | |
| LB agar | Grow Cells MS | MBPE-4040 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies | L349S9 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fischer | R415 | |
| SP6800 Spectral Analyzer | Sony | ||
| Syringe 28G 1/2" 1cc | BD | 329461 | |
| TPP Tissue Culture 48 Well Plates | MIDSCI | TP92048 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92406 | |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| Antigen | |||
| CD11b | Biolegend | Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70 | |
| CD11c | Biolegend | Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418 | |
| CD45 | Biolegend | Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11 | |
| F4/80 | Biolegend | Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8 | |
| Live/Dead | Invitrogen | Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100 | |
| Ly6C | Biolegend | Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4 | |
| MHC II | Biolegend | Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2 | |
| NK 1.1 | Biolegend | Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136 |
References
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes – from saprophyte to intracellular pathogen. Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).
- Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).
- Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA. Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).
- McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).
- Gregory, S. H., et al. Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver. Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).
- Shi, C., et al. Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression. Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).
- Pitts, M. G., Combs, T. A., D’Orazio, S. E. F. Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes. Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).
- Carr, K. D., et al. Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection. European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).
- Blériot, C., et al. Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection. Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).
- Jones, G. S., D’Orazio, S. E. F. Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche. Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).
- Agaisse, H., et al. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
- Cheng, L. W., et al. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).
- Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection. Nature. 455, 1244-1247 (2008).
- Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells. Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).
- Shrestha, N., et al. The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens. PLoS One. 8, 68754 (2013).
- Bahnan, W. The eIF2α Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking. Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).
- Kortebi, M., et al. Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells. PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).
- VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).
