Met behulp van een bacteriële ziekteverwekker sonde voor Cellulair en Organismic niveau Host Reacties
Summary
We beschrijven beide tests in vitro en in vivo infectie die kunnen worden gebruikt voor het analyseren van de activiteiten van host-encoding factoren.
Abstract
Er zijn een verscheidenheid van strategieën bacteriële pathogenen in dienst om te overleven en eenmaal binnen de eukaryote cel vermenigvuldigen. De zogenaamde ‘cytosolische’ pathogenen (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensisen Rickettsia spp) toegang tot de geïnfecteerde cel cytosol door fysiek en enzymatisch verlaagt het primaire vacuolar membraan. Eenmaal in het cytosol, deze ziekteverwekkers zowel vermenigvuldigen als het genereren van voldoende mechanische krachten te doordringen van het plasma-membraan van de gastheercel om nieuwe cellen infecteren. Hier, laten we zien hoe deze terminal stap van de cellulaire infectie cyclus van L. monocytogenes (Lm) kunnen worden gekwantificeerd door zowel kolonie-vormende eenheid testen en stroom cytometry en voorbeelden geven van hoe beide factoren pathogen – en host-gecodeerde effect dit proces. We tonen ook een nauwe correspondentie van Lm infectie dynamiek van gekweekte cellen in vitro geïnfecteerd en die van de hepatische cellen afgeleid van muizen geïnfecteerd in vivo. Deze functie gebaseerde testen zijn relatief eenvoudig en kunnen gemakkelijk worden opgeschaald voor ontdekking gebaseerde high-throughput schermen voor modulatoren van eukaryotische cel functie.
Introduction
Infectie-gebaseerde experimentele modellen zijn inherent uitdagend vanwege hun afhankelijkheid van de startende staat voorwaarden van de gastheer en ziekteverwekker, de verschillende pathogen infectie strategieën en de moeilijkheid van de toerekening van de pathogeen – en gastinstellingen gestuurde processen gebaseerd op de resultaten. De bacterie Listeria monocytogenes (Lm) is een ideale pathogen sonde host defense reacties vanwege haar genetische en microbiologische werkwillig, haar snelle en processive cellulaire infectie-strategie en de relatief duidelijk geworden relatie tussen de mobiele – en organismic-level infectie fenotypen. De cellulaire infectie van Lm verloopt via vier fasen1: (i) cellulaire invasie die wordt afgesloten met Lm worden omsloten binnen een vacuole; (ii) Lm-gestuurde ontbinding van de vacuole membraan en introductie van Lm in het cytosol; (iii) intracytosolic replicatie; en (iv) fysieke penetratie van het plasma-membraan dat in ofwel de infectie van de direct aangrenzende cellen (zoals in een epitheliale blad) of, in de eenzame cellen resulteert, introductie van Lm in de extracellulaire milieu. Elk van deze fasen worden gepromoot door specifieke Lm-gecodeerd factoren (hierna aangeduid als ‘virulentiefactoren’) die, wanneer verwijderd, infectie defecten veroorzaken in zowel cellulaire en dierlijke modellen. Deze algemene infectie strategie is onafhankelijk geëvolueerd door een aantal van de zogenaamde ‘cytosolische’ ziekteverwekkers2.
Kolonie-vormende eenheid (CFU) testen te evalueren zowel in vitro algemeen werkzaam zijn (dat wil zeggen, cellulaire) zo goed als in vivo (d.w.z. organismic) infectie resultaten. Naast hun hoge gevoeligheid, met name voor in vivo infecties, voorzien CFU assays in een duidelijke uitlezing pathogen invasie en intracellulair overleven/proliferatie. CFU testen zijn uitgebreid gebruikt voor het analyseren van zowel Lm en gastheer cel bepalende factoren die van invloed zijn infectie. Zo informatief als deze voorafgaande studies zijn geweest voor het analyseren van cellulaire invasie en intracytosolic replicatie, CFU testen hebben, tot de beste van onze kennis, niet gebruikt voor het bijhouden van de vierde fase van het proces van de infectie Lm : cellulaire ontsnappen. Hier beschrijven we relatief eenvoudig hoe cellulaire ontsnappingsvoorzieningen (hierna te noemen ‘opkomst’) kan worden gecontroleerd door CFU assay (en stroom cytometry) en Toon voorbeelden van hoe beide factoren pathogen – en host-gecodeerde regelen deze fase van de Lm infectie cyclus. De analyse van de terminale fase van de cellulaire Lm infectie cyclus kan maken het mogelijk om extra pathogenen en host cel infectie-specifieke factoren en activiteiten te identificeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vanwege zijn snelle en processive cellulaire infectie programma is Lm een ideale pathogen sonde van cellulaire activiteiten die van invloed zijn infectie. Een aantal gastheer factoren geïdentificeerd die positief dan wel negatief Lm cellulaire infectie11,12,13,14 beïnvloeden. Twee dergelijke gastheer factoren gekenmerkt in ons laboratorium, Perforine-2 en de Heem geregeld re…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads | Life Technologies | A10346 | |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | EMD Milipore | 110493 | |
| Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| DMEM media | Gibco | 11965-092 | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| FBS – Heat Inactivated | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648-6X500ML | |
| LB agar | Grow Cells MS | MBPE-4040 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies | L349S9 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fischer | R415 | |
| SP6800 Spectral Analyzer | Sony | ||
| Syringe 28G 1/2" 1cc | BD | 329461 | |
| TPP Tissue Culture 48 Well Plates | MIDSCI | TP92048 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92406 | |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| Antigen | |||
| CD11b | Biolegend | Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70 | |
| CD11c | Biolegend | Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418 | |
| CD45 | Biolegend | Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11 | |
| F4/80 | Biolegend | Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8 | |
| Live/Dead | Invitrogen | Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100 | |
| Ly6C | Biolegend | Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4 | |
| MHC II | Biolegend | Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2 | |
| NK 1.1 | Biolegend | Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136 |
References
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes – from saprophyte to intracellular pathogen. Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).
- Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).
- Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA. Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).
- McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).
- Gregory, S. H., et al. Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver. Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).
- Shi, C., et al. Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression. Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).
- Pitts, M. G., Combs, T. A., D’Orazio, S. E. F. Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes. Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).
- Carr, K. D., et al. Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection. European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).
- Blériot, C., et al. Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection. Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).
- Jones, G. S., D’Orazio, S. E. F. Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche. Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).
- Agaisse, H., et al. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
- Cheng, L. W., et al. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).
- Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection. Nature. 455, 1244-1247 (2008).
- Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells. Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).
- Shrestha, N., et al. The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens. PLoS One. 8, 68754 (2013).
- Bahnan, W. The eIF2α Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking. Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).
- Kortebi, M., et al. Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells. PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).
- VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).
