Использование бактериальных патогенов чтобы зонд для сотовых и организмический уровне принимающей ответов
Summary
Мы опишем, как анализы в vitro и in vivo инфекции, которые могут использоваться для анализа деятельности хост кодирования факторов.
Abstract
Существует целый ряд стратегий, которые используют бактериальных патогенов выжить и размножаться раз внутри эукариотической клетки. Так называемые «цитозольной» патогенов (Listeria monocytogenes, шигеллам Флекснера, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensisи риккетсии spp.) получить доступ к зараженной клетки цитозоле физически и ферментативно унижающего достоинство первичной вакуолярной мембраны. Однажды в цитозоле, этих патогенов как размножаться, так и создания достаточной механических сил, чтобы проникнуть плазматической мембраны клетки-хозяина, чтобы инфицировать новые клетки. Здесь мы покажем, как этот терминал шаг цикла сотовой инфекции моноцитогенес л (Lm) может быть определена количественно, образуя колонии подразделение анализов и проточной цитометрии и привести примеры как оба возбудителя и хост кодировке факторов воздействия, это процесс. Мы также показывают, тесная связь Lm инфекции динамики культивируемых клеток, инфицированных в пробирке и тех клеток печени, производные от мышей инфицированных в естественных условиях. Эти функции на основе анализов относительно просты и могут быть легко масштабируются для обнаружения на основе экранов высокой пропускной способностью для модуляторы функции эукариотических клеток.
Introduction
Инфекции на основе экспериментальной модели изначально сложным вследствие их зависимости от начального состояния узла и возбудителя, различные стратегии возбудителя инфекции и трудности приписывая возбудителя и хост-процессов на основе результатов. Бактерией листерий (Lm) стал идеальным патогена на зонд узла обороны ответы из-за его генетических и микробиологических уступчивость, его стратегии быстрого и processive клеточных инфекции и относительно ясно связь между своей сотовой и организмический уровень инфекции фенотипов. Клеточных инфекции Lm проходит через четыре этапа1: (i) сотовых вторжения, которое заключает с Lm заключены в вакуоль; (ii) Lm-растворение мембраны вакуоль и выпуска Lm в цитозоль; (iii) intracytosolic репликации; и (iv) физического проникновения плазматической мембраны, что приводит либо инфекции непосредственно смежных ячеек (например, эпителиальные лист) или, в одиночных клетках, выпуск Lm в внеклеточной окружение. Каждый из этих этапов способствует конкретным Lm-кодировке факторов (упоминаемые как «факторы вирулентности»), при удалении, вызвать инфекции дефекты в клеточном и животных моделях. Эта стратегия общие инфекции независимо претерпела ряд так называемых «цитозольной» патогенов2.
Колония формирование подразделения (CFU) анализы широко используются для оценки как в лабораторных условиях (т.е., сотовой) также как в естественных условиях (т.е., гештальтпсихология) исходы инфекции. В дополнение к их высокая чувствительность, особенно для в-vivo инфекций CFU анализов обеспечивают недвусмысленный индикации возбудителя вторжение и внутриклеточных выживания/распространения. КОЕ анализы широко использовались для анализа Lm и принимающей ячейки определяющих влияние инфекции. Как информативным, как эти предыдущие исследования были анализировать сотовой вторжения и intracytosolic репликации, кое анализов не, в меру наших знаний, были использованы для отслеживания четвертый этап процесса инфекции Lm : сотовой побег. Здесь мы описываем относительно простые средства как сотовой побега (именуемый в дальнейшем «появление») могут контролироваться пробирного CFU (а также проточной цитометрии) и показать примеры как оба возбудителя и хост кодировке факторов регулировать этот этап лм цикл инфекции. Анализ терминала фазы клеточного цикла Lm инфекции может сделать возможным определить дополнительные возбудителя и принимающей ячейки инфекции специфические факторы и мероприятия.
Protocol
Representative Results
Discussion
Из-за его быстрого и processive клеточных инфекции программа Lm является идеальным возбудителя зонда клеточной деятельности, влияющих инфекции. Были определены ряд принимающих факторов, положительно или отрицательно влияют на Lm сотовой инфекции11,12<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads | Life Technologies | A10346 | |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | EMD Milipore | 110493 | |
| Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| DMEM media | Gibco | 11965-092 | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| FBS – Heat Inactivated | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648-6X500ML | |
| LB agar | Grow Cells MS | MBPE-4040 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies | L349S9 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fischer | R415 | |
| SP6800 Spectral Analyzer | Sony | ||
| Syringe 28G 1/2" 1cc | BD | 329461 | |
| TPP Tissue Culture 48 Well Plates | MIDSCI | TP92048 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92406 | |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| Antigen | |||
| CD11b | Biolegend | Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70 | |
| CD11c | Biolegend | Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418 | |
| CD45 | Biolegend | Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11 | |
| F4/80 | Biolegend | Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8 | |
| Live/Dead | Invitrogen | Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100 | |
| Ly6C | Biolegend | Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4 | |
| MHC II | Biolegend | Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2 | |
| NK 1.1 | Biolegend | Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136 |
References
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes – from saprophyte to intracellular pathogen. Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).
- Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).
- Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA. Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).
- McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).
- Gregory, S. H., et al. Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver. Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).
- Shi, C., et al. Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression. Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).
- Pitts, M. G., Combs, T. A., D’Orazio, S. E. F. Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes. Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).
- Carr, K. D., et al. Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection. European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).
- Blériot, C., et al. Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection. Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).
- Jones, G. S., D’Orazio, S. E. F. Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche. Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).
- Agaisse, H., et al. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
- Cheng, L. W., et al. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).
- Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection. Nature. 455, 1244-1247 (2008).
- Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells. Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).
- Shrestha, N., et al. The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens. PLoS One. 8, 68754 (2013).
- Bahnan, W. The eIF2α Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking. Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).
- Kortebi, M., et al. Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells. PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).
- VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).
