استخدام مسببات الأمراض بكتيرية للتحقيق لاستجابات المضيف الخلوية ومستوى أورجانيسميك
Summary
ونحن تصف كلا فحوصات الإصابة في المختبر وفي الحية التي يمكن استخدامها لتحليل أنشطة العوامل المضيفة-ترميز.
Abstract
وهناك مجموعة متنوعة من استراتيجيات توظيف مسببات الأمراض البكتيرية البقاء على قيد الحياة وتتكاثر مرة واحدة داخل الخلية حقيقية النواة. مسببات الأمراض ما يسمى ‘سيتوسوليك’ (الليستريه المستوحدة، فليكسنيري دوسنتارياو بوركهولدريا pseudomallei، فرانسيسيلا تولارنسيسو الريكتسية spp.) الوصول إلى سيتوسول الخلية المصابة بها جسديا وانزيماتيكالي اللاإنسانية الغشاء فاكولار الأولية. مرة واحدة في سيتوسول، هذه العوامل الممرضة سواء تتكاثر، فضلا عن إنشاء قوات ميكانيكية كافية لاختراق غشاء بلازما الخلية المضيفة لتصيب خلايا جديدة. وهنا نعرض كيف يمكن قياس التدفق الخلوي بتشكيل مستعمرة فحوصات وحدة هذه الخطوة المحطة الطرفية دورة العدوى الخلوية لام الليستريه (Lm) وإعطاء أمثلة عن كيف كلا تأثير العوامل الخاصة بالعوامل الممرضة والمضيفة المشفرة هذه عملية. نعرض أيضا إصابة تناظر وثيق Lm العدوى ديناميات الخلايا المزروعة في المختبر وتلك الخلايا الكبدية المستمدة من الفئران المصابة المجراة. هذه الاختبارات الدالة على أساس بسيط نسبيا ويمكن الارتقاء بسهولة للقائم على اكتشاف شاشات الفائق للتضمين وظيفة الخلية حقيقية النواة.
Introduction
نماذج تجريبية على أساس الإصابة بطبيعتها صعبة بسبب اعتمادها على ظروف انطلاق الدولة المضيفة والممرض ومختلف الاستراتيجيات الإصابة بمسببات المرض وصعوبة إسناد العمليات يحركها العوامل الممرضة والمضيفة استناداً إلى النتائج. بكتيريا الليستريه المستوحدة (Lm) قد أصبح ممرض مثالي سبر ردود الدفاع المضيف بسبب لها الصوبة الوراثية والميكروبيولوجية واستراتيجيتها للعدوى الخلوي السريع وبروسيسيفي وواضحة نسبيا العلاقة بين تعمل العدوى المستوى الخلوي وأورجانيسميك به. العدوى الخلوية من Lm العائدات من خلال أربع مراحل متميزة1: (ط) غزو الهاتف الخلوي الذي يختتم Lm يجري المحاطة المنقبضة؛ (ثانيا) Lm-توجه انحلال الغشاء المنقبضة وإطلاق Lm في سيتوسول؛ (ثالثا) النسخ المتماثل إينتراسيتوسوليك؛ واختراق غشاء البلازما تنتج أما العدوى من الخلايا المجاورة مباشرة (مثل ورقة الظهارية)، أو في زنزانات انفرادية، إطلاق سراح Lm في الوسط خارج الخلية الجسدية (رابعا). كل مرحلة من هذه المراحل التي تروجها محددة Lm-ترميز العوامل (يشار إليها على أنها ‘عوامل الفوعة’)، عند حذف، يسبب تشوهات العدوى في النماذج الخلوية والحيوانات على حد سواء. هذه الاستراتيجية العامة العدوى تطورت بشكل مستقل بعدد من العوامل الممرضة ‘سيتوسوليك’ ما يسمى2.
تشكيل مستعمرة فحوصات وحدة (زيمبابوي) تستخدم على نطاق واسع لتقييم سواء في المختبر (أي الخلوية) كذلك كما في الحية (أي، أورجانيسميك) نتائج الإصابة. بالإضافة إلى حساسيتها عالية، خاصة بالنسبة للإصابات في المجراة، توفير فحوصات زيمبابوي قراءات لا لبس فيها لغزو العوامل الممرضة والبقاء على قيد الحياة/الانتشار داخل الخلايا. فحوصات زيمبابوي قد استخدمت على نطاق واسع لتحليل المحددات خلية Lm والمضيفة التي تؤثر على الإصابة. وكانت هذه الدراسات السابقة لتحليل الغزو الخلوية والنسخ المتماثل إينتراسيتوسوليك الإعلامية، فحوصات زيمبابوي لم، على حد علمنا، تستخدم لتعقب المرحلة الرابعة من عملية العدوى Lm : الهروب الخلوية. هنا، يمكننا وصف بسيط نسبيا يمكن رصد وسائل الهروب كيف الخلوية (يشار إليه فيما يلي ‘ظهور’) مقايسة زيمبابوي (فضلا عن التدفق الخلوي) وأمثلة تبين كيف كل العوامل الخاصة بالعوامل الممرضة والمضيفة المشفرة تنظيم هذه المرحلة من Lm دورة العدوى. تحليل المرحلة النهائية من دورة العدوى Lm الخلوية قد تجعل من الممكن تحديد الممرض إضافية وعوامل محددة لعدوى الخلية المضيفة والأنشطة.
Protocol
Representative Results
Discussion
بسبب برنامجها العدوى الخلوي السريع وبروسيسيفي وهو Lm ممرض مثالي للتحقيق في الأنشطة الخلوية التي تؤثر على الإصابة. قد حددت عددا من العوامل المضيفة سواء سلبا أو إيجاباً تؤثر على Lm العدوى الخلوية11،12،،من1314. اثنين…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads | Life Technologies | A10346 | |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | EMD Milipore | 110493 | |
| Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| DMEM media | Gibco | 11965-092 | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| FBS – Heat Inactivated | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648-6X500ML | |
| LB agar | Grow Cells MS | MBPE-4040 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies | L349S9 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fischer | R415 | |
| SP6800 Spectral Analyzer | Sony | ||
| Syringe 28G 1/2" 1cc | BD | 329461 | |
| TPP Tissue Culture 48 Well Plates | MIDSCI | TP92048 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92406 | |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| Antigen | |||
| CD11b | Biolegend | Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70 | |
| CD11c | Biolegend | Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418 | |
| CD45 | Biolegend | Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11 | |
| F4/80 | Biolegend | Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8 | |
| Live/Dead | Invitrogen | Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100 | |
| Ly6C | Biolegend | Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4 | |
| MHC II | Biolegend | Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2 | |
| NK 1.1 | Biolegend | Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136 |
References
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes – from saprophyte to intracellular pathogen. Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).
- Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).
- Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA. Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).
- McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).
- Gregory, S. H., et al. Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver. Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).
- Shi, C., et al. Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression. Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).
- Pitts, M. G., Combs, T. A., D’Orazio, S. E. F. Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes. Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).
- Carr, K. D., et al. Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection. European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).
- Blériot, C., et al. Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection. Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).
- Jones, G. S., D’Orazio, S. E. F. Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche. Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).
- Agaisse, H., et al. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
- Cheng, L. W., et al. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).
- Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection. Nature. 455, 1244-1247 (2008).
- Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells. Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).
- Shrestha, N., et al. The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens. PLoS One. 8, 68754 (2013).
- Bahnan, W. The eIF2α Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking. Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).
- Kortebi, M., et al. Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells. PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).
- VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).
