Usando um patógeno bacteriano para sonda para celular e organísmica-nível Host respostas
Summary
Descrevemos dois ensaios in vitro e in vivo de infecção que podem ser usados para analisar as atividades dos fatores do hospedeiro-codificação.
Abstract
Há uma variedade de estratégias de patógenos bacterianos empregam para sobreviver e proliferar uma vez dentro da célula eucariótica. Os chamados ‘citosólico’ patógenos (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensise Rickettsia spp.) ter acesso para o citoplasma da célula infectada pelo fisicamente e enzimaticamente degradante a membrana vacuolar primária. Uma vez no citosol, estes patógenos proliferam tanto geram forças mecânicas suficientes para penetrar a membrana plasmática da célula hospedeira para infectar novas células. Aqui, nós mostramos como essa etapa terminal do ciclo celular de infecção de L. monocytogenes (Lm) pode ser quantificada por citometria de fluxo e ensaios de unidade formadoras e dar exemplos de como ambos impacto de fatores patógeno e hospedeiro codificado – isto processo. Também mostramos uma estreita correspondência de Lm dinâmica de infecção das células cultivadas infectados in vitro e os de células hepáticas, derivadas de ratos infectados in vivo. Estes ensaios baseados em função são relativamente simples e podem ser facilmente ampliados para telas de alta produtividade baseada na descoberta de moduladores da função da célula eucariótica.
Introduction
Infecção com base em modelos experimentais são inerentemente desafiadoras devido a sua dependência sobre as condições de estado inicial do hospedeiro e patógeno, as várias estratégias de infecção do patógeno e a dificuldade de atribuir o patógeno e hospedeiro-orientado a processos com base em resultados. A bactéria Listeria monocytogenes (Lm) tornou-se um patógeno ideal para sondar as respostas de defesa do hospedeiro por causa de sua rastreabilidade genética e microbiológica, sua estratégia de infecção celular rápida e processive e relativamente clara relação entre seus fenótipos de infecção celular e organísmica-nível. A infecção celular de Lm procede por quatro fases distintas1: (i) invasão celular que conclui com Lm sendo colocadas dentro de um vacúolo; (ii) Lm-dirigido a dissolução da membrana do vacúolo e libertação de Lm no citosol; (iii) intracytosolic replicação; e (iv) penetração física da membrana plasmática que resulta na infecção de células diretamente adjacentes (tais como uma folha epitelial) ou, em celas solitárias, lançamento do Lm para o meio extracelular. Cada uma destas fases são promovidos pelo específico Lm-codificado fatores (referidos como ‘fatores de virulência’) que, quando eliminado, causar defeitos de infecção em modelos celulares e animais. Esta estratégia de infecção geral tem sido evoluiu de modo independente por vários dos chamados patógenos ‘citosólica’2.
Formadoras de Colônia (UFC) de unidade ensaios são amplamente empregados para avaliar ambos in vitro (ou seja, celulares), bem como in vivo (ou seja, organísmica) resultados de infecção. Além de sua alta sensibilidade, particularmente para infecções em vivo, CFU ensaios fornecem uma leitura ambígua para invasão do patógeno e sobrevivência/proliferação intracelular. CFU ensaios têm sido utilizados extensivamente para analisar os determinantes de célula Lm e o anfitrião que impactam a infecção. Tão informativa como estes estudos prévios foram analisar a invasão celular e replicação de intracytosolic, ensaios de UFC não, o melhor de nosso conhecimento, foram utilizados para acompanhar a quarta fase do processo de infecção de Lm : fuga de celular. Aqui, descrevemos relativamente simples meios de evacuação como celular (doravante referida como ’emergência’) podem ser monitorados por meio de ensaio CFU (bem como por citometria de fluxo) e mostrar exemplos de como os dois fatores do patógeno e hospedeiro codificado – regulam esta fase da Lm ciclo de infecção. A análise da fase terminal do ciclo celular Lm infecção pode tornar possível identificar atividades e fatores de infecção específica de célula do hospedeiro e patógeno adicional.
Protocol
Representative Results
Discussion
Devido a seu programa de infecção celular rápida e processive, Lm é um patógeno ideal para sondar celulares atividades que impactam a infecção. Foram identificada uma série de fatores do hospedeiro que positivamente ou negativamente afetar Lm infecção celular11,12,13,14. Dois desses hospedam fatores caracteriza-se em nosso laboratório, perforina-2 e o inibidor de He…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads | Life Technologies | A10346 | |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | EMD Milipore | 110493 | |
| Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| DMEM media | Gibco | 11965-092 | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| FBS – Heat Inactivated | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648-6X500ML | |
| LB agar | Grow Cells MS | MBPE-4040 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies | L349S9 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fischer | R415 | |
| SP6800 Spectral Analyzer | Sony | ||
| Syringe 28G 1/2" 1cc | BD | 329461 | |
| TPP Tissue Culture 48 Well Plates | MIDSCI | TP92048 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92406 | |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| Antigen | |||
| CD11b | Biolegend | Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70 | |
| CD11c | Biolegend | Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418 | |
| CD45 | Biolegend | Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11 | |
| F4/80 | Biolegend | Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8 | |
| Live/Dead | Invitrogen | Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100 | |
| Ly6C | Biolegend | Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4 | |
| MHC II | Biolegend | Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2 | |
| NK 1.1 | Biolegend | Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136 |
References
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes – from saprophyte to intracellular pathogen. Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).
- Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).
- Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA. Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).
- McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).
- Gregory, S. H., et al. Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver. Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).
- Shi, C., et al. Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression. Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).
- Pitts, M. G., Combs, T. A., D’Orazio, S. E. F. Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes. Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).
- Carr, K. D., et al. Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection. European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).
- Blériot, C., et al. Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection. Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).
- Jones, G. S., D’Orazio, S. E. F. Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche. Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).
- Agaisse, H., et al. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
- Cheng, L. W., et al. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).
- Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection. Nature. 455, 1244-1247 (2008).
- Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells. Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).
- Shrestha, N., et al. The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens. PLoS One. 8, 68754 (2013).
- Bahnan, W. The eIF2α Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking. Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).
- Kortebi, M., et al. Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells. PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).
- VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).
