Summary

Протеомного анализа человека макрофагов поляризации в среде с низким содержанием кислорода

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

Мы представляем протокол для получения подписи proteomic человека макрофагов и применить это к определению влияния среды низким содержанием кислорода на макрофагов поляризации.

Abstract

Макрофаги являются врожденные иммунные клетки, участвует в ряде физиологических функций, начиная от ответов на инфекционных возбудителей ткани гомеостаза. Различные функции этих клеток связаны с их активации государств, которая также называется поляризации. Молекулярные точное описание этих различных поляризациях является одной из приоритетных задач в области биологии макрофагов. В настоящее время признается, что многоаспектный подход необходимо описать как поляризации контролируется экологические сигналы. В настоящем докладе мы описываем протокол, разработанный для получения proteomic подписания различных поляризациях в человека макрофагов. Этот протокол основан на лейбл свободный количественной оценки экспрессии белков макрофагов, полученные из геля фракционированный и Lys C/трипсина переваривается лизис клеточных содержание. Мы также предоставляем протокол, основанный на пищеварение-решение и изоэлектрического, сосредоточив внимание фракционирование для использования в качестве альтернативы. Поскольку концентрация кислорода соответствующих экологических параметров в тканях, мы используем этот протокол для изучения состава как атмосферы или среде с низким содержанием кислорода влияет на классификации макрофагов поляризации.

Introduction

Макрофаги являются врожденные иммунные клетки участвуют в осуществлении ряда физиологических функций, начиная от ответов на инфекционных возбудителей ткани гомеостаза, включая вывоз apoptotic клеток и реорганизацию внеклеточная матрица1. Эти клетки характеризуются сильной фенотипические пластичности2 , который переводит на многие государства возможности активации, которые также называются поляризаций. Молекулярные точное описание этих различных поляризациях является одной из приоритетных задач в области биологии макрофагов3. Было предложено классифицировать эти поляризаций, используя так называемые дихотомия М1/м2, в котором M1 представляет провоспалительных и м2 представляет противовоспалительное макрофагов. Эта модель хорошо вписывается в различных патологических ситуациях как острые инфекции, аллергии и ожирение4. Однако в хронически воспаленных тканей и рака, было продемонстрировано, что эта классификация не в состоянии понять широкий репертуар фенотипические, что макрофаги в некоторых сотовых средах5,6, 7. Нынешний консенсус является что макрофагов поляризации лучше описывается использование многомерной модели для интеграции конкретных сигналов microenvironmental8. Этот вывод был подтвержден путем анализа транскриптомики человека макрофагов, показывая, что модель М1/м2 является неэффективным в описании полученные поляризаций9.

Это исследование представлено призвана обеспечить протокол для получения proteomic подписи различных поляризациях в человека макрофагов. Мы опишем, как отличить человека макрофагов в средах различных уровней кислорода и получать пептиды от всей макрофагов протеома выполнить количественную оценку лейбл бесплатно. Эта количественная оценка позволяет сравнивать уровни выражения различных белков. Как исследование стволовых клеток показал важность кислорода в качестве экологического параметра key10, мы стремимся понять, как этот параметр ткани может повлиять макрофагов поляризации в организме человека. Парциальное давление кислорода было установлено в диапазоне от 3 до 20% (общее атмосферное давление) в человеческом теле, где 20% примерно соответствует то, что обычно используется в инкубатор культуры клеток (точное значение составляет 18,6% принимая присутствие воды во внимание).

Предыдущие работы показал, что альвеолярные отличаются от интерстициальных макрофаги от функциональных и морфологической точки просмотров11 и что эти различия, вероятно, частично из-за различных кислорода, которым они подвергаются12. Кроме того костного мозга, полученных макрофаги показывают увеличение способность фагоцитируют бактерий при контакте с низким содержанием кислорода среды12. Противоположный эффект было найдено для THP1-продифференцировано человека макрофаги13, но эти результаты поддерживают идею, что кислород является регулятор макрофагов биологии и что это необходимо уточнить эту роль на молекулярном уровне в человека макрофагов. В предыдущем исследовании мы применили протеомики подход к решению этих вопросов. Путем измерения уровня выражения для тысяч белков одновременно, мы подчеркнул влияние кислорода на поляризации и представила список новых молекулярных маркеров. Мы также смогли увязать эти результаты некоторых функций макрофагов. В частности мы обнаружили, что уровень фагоцитоз apoptotic клеток был увеличен в IL4/IL13-поляризованных макрофагов, который был связан с upregulation ALOX15, как свидетельствуют протеомного анализа14. В настоящем исследовании мы опишем, как для выполнения такого анализа.

Protocol

Образцы крови человека (LRSC) от здоровых, обезличенных доноров были получены из EFS (Французская Национальная служба крови) как часть протокола уполномоченным (CODECOH DC-2018 – 3114). Доноры дали подписанного согласия для использования крови. 1. средства массовой информации и подгот?…

Representative Results

Начиная от мононуклеарных клеток периферической крови (получения) получено дифференциального центрифугирования, Протокол допускает получение населением CD14+ моноциты с начисленных чистоты более чем 98% проточной цитометрии (рис. 1). Вторично эти м…

Discussion

Потому что протеомики является мощным инструментом для изучения выражение различных белков от всей ячейки или субцеллюлярные отсеков, Оптимизация протокола лизис клеток и переваривание белков рассматривался ряд исследований. Существует три основных класса методов, которые включают…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

AM финансируется по программе лидер группы молодых (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), la le Национальная лига против рака и la Fondation дуги pour la recherche sur le рака. Мы благодарим Mariette Матондо от масс-спектрометрии для биологии платформы (UTECHS MSBIO, Институт Пастера, Париж). Мы благодарим Лорен Андерсон за ее чтение рукописи.

Materials

Hypoxia Working Station Oxford Optronix Hypoxylab
C6 Flow cytometer BD Accuri C6
Urea Agilent Technologies 5188-6435
Formic acid (FA) ARISTAR 450122M
R-250 Coomassie blue Biorad 1,610,436
Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS) Calbiochem 437627
2D clean-up kit GE Healthcare 80-6484-51
RPMI 1640 medium, glutamax supplement Gibco 61870044
HEPES 1 M Gibco 15630-080
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X Gibco 11140-035
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X Gibco 14190-094
Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column Harvard Apparatus 74-4601
EDTA 0.5 M, pH 8.0 Invitrogen AM9260G
NuPAGE Bis-Tris 4-12% Life Technologies SAS NP0321 BOX
CD14 Microbeads human Miltenyi Biotec 130-050-201
MACS separation column LS Miltenyi Biotec 130-042-401
Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) Miltenyi Biotec 130-096-485
Interleukin 4 (IL4) Miltenyi Biotec 130-093-917
Interleukin 13 (IL13) Miltenyi Biotec 130-112-410
Interferon gamma (INFγ) Miltenyi Biotec 130-096-482
CD14-FITC (clone TÜK4) Miltenyi Biotec 130-080-701
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753
Trifluoroacetic Acid (TFA) Pierce 28904
Trypsin/Lys-C Mix PROMEGA V5073
Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail Roche 11836170001
Density Gradient Solution (Histopaque 1077) Sigma Aldrich 10771-100ML
Accumax Sigma Aldrich A7089-100ML
Human Serum from human male AB plasma (SAB) Sigma Aldrich H4522-100ML
Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30% Sigma Aldrich A9576-50ML
Trisma-base Sigma Aldrich T1503
Glycerol Sigma Aldrich 49767
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148
Bromophenol blue Sigma Aldrich 114405
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20% Sigma Aldrich 5030
Ammonium bicarbonate Sigma Aldrich 9830
Acetonitrile Sigma Aldrich 34888
Dithiothreitol Sigma Aldrich 43819
Iodoacetamide Sigma Aldrich 57670
Thiourea Sigma Aldrich T8656
CHAPS Sigma Aldrich C9426
Micro BCA Assay Kit ThermoFisher 23235
5 mL sterile plastic pipette VWR 612-1685
Thermomixer C Eppendorf VWR 460-0223
Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg Waters WAT036820

References

  1. Okabe, Y., Medzhitov, R. Tissue biology perspective on macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).
  2. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
  3. Murray, P. J. Macrophage Polarization. Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).
  4. Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation. Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).
  5. Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
  6. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
  7. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
  8. Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
  9. Xue, J., et al. Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation. Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).
  10. Csete, M. Oxygen in the cultivation of stem cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).
  11. Johansson, A., et al. Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).
  12. Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).
  13. Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line. PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).
  14. Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).
  15. Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
  16. Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
  17. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  18. Court, M., et al. Toward a standardized urine proteome analysis methodology. Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).
  19. Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  20. Liebler, D. C., Ham, A. -. J. L. Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics. Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).
  21. Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis. Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).
  22. Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
  23. Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells. Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
  24. Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
  25. Lengner, C. J., et al. Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations. Cell. 141 (5), 872-883 (2010).
  26. Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology. Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).

Play Video

Cite This Article
Court, M., Malier, M., Millet, A. Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment. J. Vis. Exp. (143), e58727, doi:10.3791/58727 (2019).

View Video