ניתוח פרוטיאומיה מבנית של קיטוב מקרופאג האנושי תחת סביבה חמצן נמוך
Summary
אנו מציגים פרוטוקול כדי להשיג חתימות פרוטיאומיה מבנית של מקרופאגים האנושית ואת ליישם את זה נחישות ההשפעה של סביבה חמצן נמוך על מקרופאג קיטוב.
Abstract
המקרופאגים הם תאים חיסוניים מולדת מעורב מספר פונקציות פיזיולוגיים ועד תגובות למחלות זיהומיות רקמות הומאוסטזיס. הפונקציות השונות של תאים אלה קשורים הברית ההפעלה שלהם, אשר נקרא גם קיטוב. תיאור מדויק מולקולרית של polarizations שונים אלה היא עדיפות בתחום הביולוגיה מקרופאג. זה כרגע הוא הודה כי בגישה רב-ממדי הכרחי לתאר איך קיטוב נשלטת על ידי אותות סביבתיים. בדו ח זה, אנו מתארים פרוטוקול המיועד להשיג את החתימה פרוטיאומיה מבנית של polarizations שונים ב מקרופאגים אנושי. פרוטוקול זה מבוסס על כימות ללא תווית של ביטוי חלבון מקרופאג המתקבל בבית-ג’ל fractionated ותוכן פירוק התאית Lys C/טריפסין-מעוכלים. אנו מספקים גם פרוטוקול מבוסס על עיכול תוך-פתרון ו לגירויי כאב תוך התמקדות fractionation להשתמש כחלופה. בגלל ריכוז חמצן הוא פרמטר הסביבתיים הרלוונטיים ברקמות, אנו משתמשים בפרוטוקול זה לחקור את הרכב האטמוספירה איך או סביבה חמצן נמוך משפיע על הסיווג של מקרופאג קיטוב.
Introduction
המקרופאגים הם תאים חיסוניים מולדת מעורב מספר פונקציות פיזיולוגיים ועד רקמות הומאוסטזיס, כולל הסרה של מוות תאים ו remodelling של מטריצה חוץ-תאית1תגובות למחלות זיהומיות. תאים אלה מאופיינים חזק פנוטיפית2 שמתרגמת מדינות רבות הפעלה אפשריים, אשר נקראים גם polarizations. תיאור מדויק מולקולרית של polarizations שונים אלה היא עדיפות בתחום הביולוגיה מקרופאג3. זה הוצע לסווג אלה polarizations באמצעות הדיכוטומיה M1/M2 כביכול, שבו M1 מייצג פרו דלקתיים ו M2 מייצג מקרופאגים אנטי דלקתיות. מודל זה מתאים גם מצבים פתולוגיים שונים כמו זיהומים חריפים, אלרגיה, השמנת יתר4. עם זאת, רקמות דלקתי כרוני, סרטן, זה הוכח כי סיווג זה אינו מסוגל להבין את הרפרטואר פנוטיפי הרחב שמציגים מקרופאגים מסוימים סביבות הסלולר5,6, 7. הקונצנזוס הנוכחי הוא מקרופאג קיטוב יותר מתואר באמצעות מודל רב-ממדי כדי לשלב את אותות מסוימים microenvironmental8. מסקנה זו אושרה באמצעות ניתוח transcriptomic של מקרופאגים האנושי מראה כי המודל M1/M2 הוא יעיל בתיאור שהושג polarizations9.
המחקר הציג שואפת לספק פרוטוקול להשיג חתימות פרוטיאומיה מבנית של polarizations שונים ב מקרופאגים אנושי. אנחנו מתארים כיצד להבדיל מקרופאגים האנושי בסביבות של רמות החמצן שונים ולקבל פפטידים פרוטאום מקרופאג כל לביצוע של כימות ללא תווית. כימות זו מאפשרת ההשוואה של רמות ביטוי של חלבונים שונים. כמו מחקר בתאי גזע חשף את חשיבות החמצן הסביבה פרמטר מפתח10, אנו שואפים להבין כיצד פרמטר רקמות יכולים להשפיע על קיטוב מקרופאג בבני אדם. לחץ חלקי של חמצן נמצאה בטווח מ-3 עד 20% (לחץ אטמוספרי סך) בגוף האדם, שבו 20% מקביל בערך מה הוא נפוץ של חממה התרבות התא (הערך המדויק הוא בסביבות 18.6% בזמן נטילת הנוכחות של מים בחשבון).
עבודה קודמים הראו כי מכתשי נבדלים בין-תאי מקרופאגים מ פונקציונלי, נקודת מורפולוגי של נופים11 וכי ההבדלים הללו הם כנראה חלקית עקב רמות החמצן שונים שאליהם הם חשופים12. יתר על כן, מקרופאגים הנגזרות מח עצם מראים יכולת מוגברת כדי phagocytize חיידקים כאשר הם נחשפים בסביבת חמצן נמוך12. האפקט ההפוך נמצאה עבור מקרופאגים האנושי הבדיל THP113, אך תוצאות אלו תומך את הרעיון כי חמצן הוא מווסת של ביולוגיה מקרופאג וכי זהו צורך להבהיר את התפקיד הזה ברמה המולקולרית בתוך המקרופאגים אנושי. במחקר הקודם, אנחנו החלת בגישה פרוטאומיקס לטיפול בבעיות אלה. על ידי מדידת רמות הביטוי אלפי חלבונים בו-זמנית, אנו הדגיש את ההשפעה של חמצן על קיטוב, מספק רשימה של סמנים מולקולריים חדשים. הצלחנו גם להתייחס ממצאים אלה כמה פונקציות מקרופאגים. ראוי לציין, מצאנו כי הקצב של phagocytosis של מוות תאים הוגדל ב IL4/IL13-מקוטב מקרופאגים, אשר היה קשור קולטנים upregulation של ALOX15 כפי ניתוח פרוטיאומיה מבנית14. במחקר הנוכחי, אנו נתאר כיצד לבצע ניתוח כזה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מכיוון פרוטאומיקס הוא כלי רב עוצמה כדי ללמוד הביטוי של חלבונים שונים תא שלם או תאים subcellular, אופטימיזציה של פרוטוקול פירוק תא ועיכול של חלבונים טופלה על ידי מספר מחקרים. יש שלוש מחלקות עיקריות של שיטות, הכוללים בג’ל עיכול (עיכול חלבונים במטריצת לזיהוי ג’ל)17, עיכול פתרון…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AM ממומן על-ידי התוכנית מנהיג קבוצה צעירה (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), על ידי לה ליגה נאסיונאל חדר מרווח וחדיש le סרטן ו la Fondation ARC למזוג לה רשרש sur le סרטן. אנו מודים מארייט Matondo מספקטרומטריית לפלטפורמה ביולוגיה (UTECHS MSBIO, מכון פסטר, פריז). אנו מודים לורן אנדרסון על אותה קריאה של כתב היד.
Materials
| Hypoxia Working Station | Oxford Optronix | Hypoxylab | |
| C6 Flow cytometer | BD | Accuri C6 | |
| Urea | Agilent Technologies | 5188-6435 | |
| Formic acid (FA) | ARISTAR | 450122M | |
| R-250 Coomassie blue | Biorad | 1,610,436 | |
| Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS) | Calbiochem | 437627 | |
| 2D clean-up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| RPMI 1640 medium, glutamax supplement | Gibco | 61870044 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X | Gibco | 11140-035 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column | Harvard Apparatus | 74-4601 | |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| NuPAGE Bis-Tris 4-12% | Life Technologies SAS | NP0321 BOX | |
| CD14 Microbeads human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| MACS separation column LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) | Miltenyi Biotec | 130-096-485 | |
| Interleukin 4 (IL4) | Miltenyi Biotec | 130-093-917 | |
| Interleukin 13 (IL13) | Miltenyi Biotec | 130-112-410 | |
| Interferon gamma (INFγ) | Miltenyi Biotec | 130-096-482 | |
| CD14-FITC (clone TÜK4) | Miltenyi Biotec | 130-080-701 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Pierce | 28904 | |
| Trypsin/Lys-C Mix | PROMEGA | V5073 | |
| Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Density Gradient Solution (Histopaque 1077) | Sigma Aldrich | 10771-100ML | |
| Accumax | Sigma Aldrich | A7089-100ML | |
| Human Serum from human male AB plasma (SAB) | Sigma Aldrich | H4522-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30% | Sigma Aldrich | A9576-50ML | |
| Trisma-base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | 49767 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 114405 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20% | Sigma Aldrich | 5030 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34888 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | 57670 | |
| Thiourea | Sigma Aldrich | T8656 | |
| CHAPS | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Micro BCA Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| 5 mL sterile plastic pipette | VWR | 612-1685 | |
| Thermomixer C Eppendorf | VWR | 460-0223 | |
| Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg | Waters | WAT036820 |
References
- Okabe, Y., Medzhitov, R. Tissue biology perspective on macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
- Murray, P. J. Macrophage Polarization. Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).
- Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation. Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).
- Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
- Xue, J., et al. Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation. Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).
- Csete, M. Oxygen in the cultivation of stem cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).
- Johansson, A., et al. Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).
- Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).
- Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line. PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).
- Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).
- Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Court, M., et al. Toward a standardized urine proteome analysis methodology. Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).
- Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
- Liebler, D. C., Ham, A. -. J. L. Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics. Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).
- Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis. Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).
- Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells. Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
- Lengner, C. J., et al. Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations. Cell. 141 (5), 872-883 (2010).
- Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology. Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).
