Summary

Proteomic Analysen der menschlichen Makrophagen Polarisierung in einer sauerstoffarmen Umgebung

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll zur Proteomic Unterschriften von menschlichen Makrophagen und wenden Sie diese zur Bestimmung der Auswirkungen einer sauerstoffarmen Umgebung auf Makrophagen Polarisation.

Abstract

Makrophagen sind angeborene Immunzellen beteiligt in einer Reihe von physiologischen Funktionen von Antworten auf infektiöse Erreger bis hin zu Gewebe Homöostase. Die verschiedenen Funktionen dieser Zellen beziehen sich auf deren Aktivierungsstatus die Polarisation auch genannt. Der genaue molekulare Beschreibung dieser verschiedenen Polarisationen ist eine Priorität im Bereich der Makrophagen Biologie. Anerkanntermaßen ist derzeit die ein mehrdimensionaler Ansatz ist notwendig, um zu beschreiben wie Polarisation durch Umweltsignale gesteuert wird. In diesem Bericht beschreiben wir ein Protokoll entwickelt, um die Proteomik-Signatur von verschiedenen Polarisationen in menschliche Makrophagen zu erhalten. Dieses Protokoll basiert auf einem markierungsfreie Quantifizierung der Makrophagen-Protein-Expression von fraktioniert auf dem Gel und Lys C/Trypsin-verdaut zellulären Lyse Inhalt erhalten. Wir bieten auch ein Protokoll basierend auf in-Lösung Verdauung und isoelektrischen Fokussierung Fraktionierung, als Alternative zu verwenden. Da Sauerstoff-Konzentration einen relevanten ökologischen Parameter im Gewebe ist, verwenden wir dieses Protokoll, um wie atmosphärische Zusammensetzung zu erkunden oder eine sauerstoffarmen Umgebung wirkt sich auf die Klassifizierung von Makrophagen Polarisation.

Introduction

Makrophagen sind angeborene Immunzellen beteiligt in einer Reihe von physiologischen Funktionen von Antworten auf infektiöse Erreger bis hin zu Gewebe Homöostase, einschließlich der Entfernung des apoptotischen Zellen und der extrazellulären Matrix1Umbau. Diese Zellen zeichnen sich durch eine starke phänotypische Plastizität2 , die in einem viele mögliche Aktivierung Staaten übersetzt die Polarisationen auch genannt werden. Der genaue molekulare Beschreibung dieser verschiedenen Polarisationen ist eine Priorität im Bereich der Makrophagen Biologie3. Es wurde vorgeschlagen, diese mit Hilfe der sogenannten M1/M2 Dichotomie, in denen M1 steht Pro-inflammatorischen und M2 für entzündungshemmende Makrophagen Polarisationen zu klassifizieren. Dieses Modell passt gut in verschiedenen pathologischen Situationen wie akute Infektionen, Allergien und Übergewicht4. Allerdings wurde in chronisch entzündeten Geweben und Krebs nachgewiesen, dass diese Klassifizierung nicht in der Lage ist, das breite phänotypische Repertoire zu erfassen, das Makrophagen in bestimmten zellulären Umgebungen5,6, zu präsentieren 7. der aktuelle Konsens ist, dass Makrophagen Polarisation besser ein mehrdimensionales Modell beschrieben ist, um spezifische microenvironmental Signale8zu integrieren. Diese Schlussfolgerung wurde bestätigt durch die transkriptomischen Analyse der menschlichen Makrophagen, die zeigen, dass das Modell M1/M2 bei der Beschreibung der erhaltenen Polarisationen9ineffizient ist.

Die Studie präsentiert zielt darauf ab, ein Protokoll zur Proteomic Unterschriften von verschiedenen Polarisationen in menschliche Makrophagen zu erhalten. Wir beschreiben, wie menschliche Makrophagen im Umfeld der verschiedenen Sauerstoff-Niveaus zu unterscheiden und das ganze Makrophagen Proteom markierungsfreie Quantifizierung durchführen Peptide einzuholen. Diese Quantifizierung ermöglicht den Vergleich der Ausdruck verschiedener Proteine. Wie die Forschung an Stammzellen die Bedeutung von Sauerstoff als eine ökologische Schlüsselparameter10gezeigt hat, versuchen wir zu verstehen, wie dieser Parameter Gewebe Makrophagen Polarisierung in den Menschen beeinflussen kann. Der Partialdruck des Sauerstoffs ist Reichweite von 3 bis 20 % (des gesamten atmosphärischen Drucks) im menschlichen Körper gefunden worden wo entspricht in etwa 20 %, was in einer Zelle Kultur Inkubator verbreitet ist (der genaue Wert ist rund 18,6 % während der Einnahme der Anwesenheit von Wasser nicht berücksichtigt).

Bisherigen Arbeit hat gezeigt, dass alveoläre unterscheiden sich von interstitielle Makrophagen aus funktionellen und morphologischen Ansichten11 und diese Unterschiede wahrscheinlich teilweise aufgrund der unterschiedlichen Sauerstoff-Niveaus sind, die sie ausgesetzt12sind. Darüber hinaus zeigen dem Knochenmark stammenden Makrophagen eine erhöhte Fähigkeit, Bakterien bei einer sauerstoffarmen Umgebung12phagocytize. Der gegenteiligen Effekt hat für THP1 differenziert menschliche Makrophagen13gefunden worden, aber diese Ergebnisse unterstützen die Idee, dass Sauerstoff ein Regulator von Makrophagen Biologie ist, es ist zu klären, diese Rolle auf molekularer Ebene in menschliche Makrophagen. In einer früheren Studie haben wir einen Proteomics-Ansatz zur Behebung dieser Probleme angewendet. Durch gleichzeitige Messung Ausdruck Niveaus für Tausende von Proteinen, wir haben die Auswirkungen von Sauerstoff auf Polarisierung und stellte eine Liste von neuen molekularen Markern. Wir waren auch in der Lage, diese Erkenntnisse zu einigen Funktionen der Makrophagen zu beziehen. Vor allem fanden wir, dass die Rate der Phagozytose apoptotischer Zellen im IL4/IL13-polarisierten Makrophagen erhöht wurde, die an die Hochregulation des ALOX15 gebunden war, wie der Proteomik Analyse14offenbart. In der vorliegenden Studie beschreiben wir wie eine solche Analyse durchführen.

Protocol

Menschlichen Blutproben (LRSC) von gesunden, anonymisierte Spender wurden von EFS (Französisch nationalen Blut Service) im Rahmen eines genehmigten Protokolls (CODECOH DC-2018-3114) erhalten. Gebern gab unterschriebene Zustimmung für die Verwendung von Blut. (1) Medien und Puffer-Vorbereitung Bereiten Sie die Makrophagen Medium [RPMI Glutamax + 10 mM HEPES + 1 X nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA)] und auf 37 ° c warm Vorbereiten der Makrophagen Medium + 10 % humanem …

Representative Results

Ausgehend von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) durch differentielle Zentrifugation gewonnen, das Protokoll ermöglicht den Erhalt einer Population von CD14+ Monozyten mit einem veranlagten Reinheit von mehr als 98 % von Durchflusszytometrie (Abbildung 1). Diese Monozyten werden sekundär gegenüber verschiedenen Polarisationen (Abbildung 2) unterschieden. Wenn eine Fraktionierung auf Gel gewählt, die Migra…

Discussion

Da Proteomics ein mächtiges Werkzeug ist, um den Ausdruck verschiedener Proteine aus einer ganzen Zelle oder subzelluläre Kompartimente zu studieren, wurde Optimierung des Protokolls Zelle Lysis und Verdauung der Proteine durch eine Reihe von Studien behoben. Es gibt drei Hauptklassen von Methoden, die im Gel Verdauung (Verdauung von Proteinen in Polyacrylamid Gelmatrix)17, Verdauung in Lösung18 und Filter-gestützte Probe Vorbereitung19enthalten….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

AM la Ligue Nationale Contre le Cancer und la Fondation ARC pour la recherche Sur le Cancer vom Young Group Leader Programm (ATIP/Avenir Inserm-CNRS) finanziert. Wir bedanken uns bei Mariette Matondo von Massenspektrometrie für Biologie-Plattform (UTECHS MSBIO, Institut Pasteur, Paris). Wir danken Lauren Anderson für ihre Lektüre des Manuskripts.

Materials

Hypoxia Working Station Oxford Optronix Hypoxylab
C6 Flow cytometer BD Accuri C6
Urea Agilent Technologies 5188-6435
Formic acid (FA) ARISTAR 450122M
R-250 Coomassie blue Biorad 1,610,436
Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS) Calbiochem 437627
2D clean-up kit GE Healthcare 80-6484-51
RPMI 1640 medium, glutamax supplement Gibco 61870044
HEPES 1 M Gibco 15630-080
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X Gibco 11140-035
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X Gibco 14190-094
Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column Harvard Apparatus 74-4601
EDTA 0.5 M, pH 8.0 Invitrogen AM9260G
NuPAGE Bis-Tris 4-12% Life Technologies SAS NP0321 BOX
CD14 Microbeads human Miltenyi Biotec 130-050-201
MACS separation column LS Miltenyi Biotec 130-042-401
Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) Miltenyi Biotec 130-096-485
Interleukin 4 (IL4) Miltenyi Biotec 130-093-917
Interleukin 13 (IL13) Miltenyi Biotec 130-112-410
Interferon gamma (INFγ) Miltenyi Biotec 130-096-482
CD14-FITC (clone TÜK4) Miltenyi Biotec 130-080-701
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753
Trifluoroacetic Acid (TFA) Pierce 28904
Trypsin/Lys-C Mix PROMEGA V5073
Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail Roche 11836170001
Density Gradient Solution (Histopaque 1077) Sigma Aldrich 10771-100ML
Accumax Sigma Aldrich A7089-100ML
Human Serum from human male AB plasma (SAB) Sigma Aldrich H4522-100ML
Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30% Sigma Aldrich A9576-50ML
Trisma-base Sigma Aldrich T1503
Glycerol Sigma Aldrich 49767
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148
Bromophenol blue Sigma Aldrich 114405
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20% Sigma Aldrich 5030
Ammonium bicarbonate Sigma Aldrich 9830
Acetonitrile Sigma Aldrich 34888
Dithiothreitol Sigma Aldrich 43819
Iodoacetamide Sigma Aldrich 57670
Thiourea Sigma Aldrich T8656
CHAPS Sigma Aldrich C9426
Micro BCA Assay Kit ThermoFisher 23235
5 mL sterile plastic pipette VWR 612-1685
Thermomixer C Eppendorf VWR 460-0223
Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg Waters WAT036820

References

  1. Okabe, Y., Medzhitov, R. Tissue biology perspective on macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).
  2. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
  3. Murray, P. J. Macrophage Polarization. Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).
  4. Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation. Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).
  5. Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
  6. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
  7. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
  8. Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
  9. Xue, J., et al. Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation. Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).
  10. Csete, M. Oxygen in the cultivation of stem cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).
  11. Johansson, A., et al. Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).
  12. Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).
  13. Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line. PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).
  14. Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).
  15. Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
  16. Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
  17. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  18. Court, M., et al. Toward a standardized urine proteome analysis methodology. Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).
  19. Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  20. Liebler, D. C., Ham, A. -. J. L. Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics. Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).
  21. Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis. Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).
  22. Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
  23. Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells. Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
  24. Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
  25. Lengner, C. J., et al. Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations. Cell. 141 (5), 872-883 (2010).
  26. Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology. Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).

Play Video

Cite This Article
Court, M., Malier, M., Millet, A. Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment. J. Vis. Exp. (143), e58727, doi:10.3791/58727 (2019).

View Video