Düşük oksijen ortamı altında insan makrofaj polarizasyon proteomik analizi
Summary
Biz insan makrofajlar proteomik imzaları elde edilir ve bu düşük oksijen çevre makrofaj polarizasyon üzerindeki etkisinin belirlenmesi için geçerli bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Makrofajlar doğuştan gelen bağışıklık hücreleri doku homeostazı için yanıt Bulaşıcı patojenler için arasında değişen fizyolojik fonksiyonları bir dizi yer vardır. Bu hücrelerin çeşitli işlevlerini etkinleştirme durumlarına hangi da polarizasyon denir ilişkilidir. Bu çeşitli kutuplaşmalar hassas moleküler açıklaması makrofaj biyoloji alanında bir önceliktir. Şu anda çok boyutlu bir yaklaşım nasıl polarizasyon çevre sinyalleri tarafından kontrol edilir açıklamak gerekli olduğunu kabul edilmektedir. Bu raporda, biz insan makrofajlar içinde çeşitli kutuplaşmalar proteomik imza elde etmek için tasarlanmış bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı etiket içermeyen bir miktar jel-şeker ve Lys C/tripsin-sindirmek hücresel lizis içerik elde makrofaj protein ifade temel alır. Biz de bağlı olarak çözüm sindirim ve isoelectric alternatif olarak kullanmak için ayırma odaklanan bir protokol sağlar. Oksijen konsantrasyonu dokularda ilgili bir çevre parametresi olduğundan, biz nasıl atmosferik kompozisyon keşfetmek için bu iletişim kuralını kullanmanız veya düşük oksijen ortamı makrofaj polarizasyon sınıflandırılması etkiler.
Introduction
Makrofajlar doğuştan gelen bağışıklık hücreleri apoptotik hücreler kaldırılması da dahil olmak üzere ve hücre dışı matriks1/ remodeling doku homeostazı için yanıt Bulaşıcı patojenler için arasında değişen fizyolojik fonksiyonları bir dizi yer vardır. Bu hücreler kutuplaşmalar olarak da adlandırılan bir birçok olası etkinleştirme devlet çevirir güçlü fenotipik plastisite2 ile karakterizedir. Bu çeşitli kutuplaşmalar hassas moleküler açıklaması makrofaj biyoloji3alanında bir önceliktir. Sözde M1/M2 ikilemi M1 pro-inflamatuar temsil eder ve anti-inflamatuar makrofajlar M2 temsil eder kullanarak bu kutuplaşmalar sınıflandırmak için önerilmiştir. Bu model de akut enfeksiyonlar, alerji ve obezite4gibi çeşitli patolojik durumlar sığar. Ancak, kronik iltihaplı doku ve kanser, o bu sınıflandırma makrofajlar belirli hücresel ortamlar5,6‘, mevcut geniş fenotipik repertuar kavramak değiştiremiyor gösterilmiştir 7. makrofaj kutuplaşma daha iyi belirli microenvironmental sinyalleri8entegre etmek için bir çok boyutlu modeli kullanarak açıklanan geçerli fikir birliği olduğunu. Bu sonuç insan makrofajlar M1/M2 model elde edilen kutuplaşmalar9tanımlamada yetersiz olduğunu gösteren transcriptomic analizi ile doğrulanmıştır.
Çalışma insan makrofajlar içinde çeşitli kutuplaşmalar proteomik imzalarını edinmek için bir protokol sağlar amaçlamaktadır sundu. Biz çeşitli oksijen düzeyleri ortamlarda insan makrofajlar ayırt etmek ve peptidler etiket içermeyen bir miktar gerçekleştirmek için tüm makrofaj Proteom elde etmek nasıl açıklar. Bu miktar çeşitli proteinlerin ifade düzeylerinin karşılaştırılması sağlar. Kök hücre araştırma bir çevre anahtar parametreyi10olarak oksijen önemini ortaya koyduğu gibi bu doku parametre insanlarda makrofaj polarizasyon etkisi nasıl anlamak arıyoruz. Oksijen kısmi basınç aralığı %3 20 (Toplam atmosferik basınç) % 20 kabaca ne genellikle (tam değer %18,6 su varlığı çekerken civarındadır bir hücre kültür kuluçka kullanılır için kaynakçalara insan vücudunda bulundu hesap).
Önceki çalışma alveoler fonksiyonel üzerinden interstisyel makrofajlar farklıdır ve morfolojik nokta sayısı11 ve bu farklılıkların muhtemelen kısmen maruz kalan12oldukları farklı oksijen seviyesi nedeniyle vardır göstermiştir. Ayrıca, kemik iliği türevi makrofajlar bir düşük oksijen çevre12‘ ye maruz kaldığında bakteri işbirliği için artan bir yetenek göstermek. Tam tersi bir etki için insan makrofajlar THP1 Ayrıştırılan13buldum, ama bu sonuçlar oksijen regülatörü makrofaj biyoloji olduğunu ve insan makrofajlar moleküler düzeyde bu rolü açıklamak için gerekli fikir destek. Bir önceki çalışmada, bu sorunlara yönelik olarak proteomik yaklaşım başvurdum. Aynı anda binlerce proteinler için ifade düzeylerini ölçme tarafından oksijen polarizasyon etkisi vurgulanır ve yeni moleküler işaretleyicilerin görünümünü bir liste sunuyoruz. Ayrıca bu bulgular bazı makrofajlar işlevlerine ilişkilendirmek başardık. Özellikle, fagositoz apoptotik hücre oranı ALOX15 upregulation için proteomik analizi14tarafından ortaya bağlı IL4/IL13-polarize makrofajlar içinde artış olmuştur bulduk. Bu da çalışmanın, biz böyle bir analiz gerçekleştirmek açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Proteomik ifade bütün bir hücre veya hücre altı bölmeleri farklı proteinlerin eğitim için güçlü bir araç olduğundan, hücre lizis Protokolü duruma getirilmesi ve proteinlerin sindirim çalışmalar bir dizi tarafından ele alınmıştır. Jel sindirim (polyacrylamide jel matris proteinlerin sindirim)17, çözüm18 ve filtre destekli örnek hazırlama19sindirim dahil yöntemleri üç ana sınıf vardır. Bu son yöntem, evrensel olarak,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AM genç grup lideri programıyla (CD’ye atıp/Avenir INSERM-CNRS), la Ligue Nationale contre le kanser ve la Fondation ARC pour la recherche sur le kanser tarafından finanse edilmektedir. Kütle spektrometresi biyoloji platformu (UTECHS MSBIO, Pasteur Enstitüsü, Paris) için gelen Mariette Matondo teşekkür ediyoruz. Lauren Anderson el yazması onun okuma için teşekkür ederiz.
Materials
| Hypoxia Working Station | Oxford Optronix | Hypoxylab | |
| C6 Flow cytometer | BD | Accuri C6 | |
| Urea | Agilent Technologies | 5188-6435 | |
| Formic acid (FA) | ARISTAR | 450122M | |
| R-250 Coomassie blue | Biorad | 1,610,436 | |
| Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS) | Calbiochem | 437627 | |
| 2D clean-up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| RPMI 1640 medium, glutamax supplement | Gibco | 61870044 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X | Gibco | 11140-035 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column | Harvard Apparatus | 74-4601 | |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| NuPAGE Bis-Tris 4-12% | Life Technologies SAS | NP0321 BOX | |
| CD14 Microbeads human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| MACS separation column LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) | Miltenyi Biotec | 130-096-485 | |
| Interleukin 4 (IL4) | Miltenyi Biotec | 130-093-917 | |
| Interleukin 13 (IL13) | Miltenyi Biotec | 130-112-410 | |
| Interferon gamma (INFγ) | Miltenyi Biotec | 130-096-482 | |
| CD14-FITC (clone TÜK4) | Miltenyi Biotec | 130-080-701 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Pierce | 28904 | |
| Trypsin/Lys-C Mix | PROMEGA | V5073 | |
| Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Density Gradient Solution (Histopaque 1077) | Sigma Aldrich | 10771-100ML | |
| Accumax | Sigma Aldrich | A7089-100ML | |
| Human Serum from human male AB plasma (SAB) | Sigma Aldrich | H4522-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30% | Sigma Aldrich | A9576-50ML | |
| Trisma-base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | 49767 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 114405 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20% | Sigma Aldrich | 5030 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34888 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | 57670 | |
| Thiourea | Sigma Aldrich | T8656 | |
| CHAPS | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Micro BCA Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| 5 mL sterile plastic pipette | VWR | 612-1685 | |
| Thermomixer C Eppendorf | VWR | 460-0223 | |
| Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg | Waters | WAT036820 |
References
- Okabe, Y., Medzhitov, R. Tissue biology perspective on macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
- Murray, P. J. Macrophage Polarization. Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).
- Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation. Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).
- Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
- Xue, J., et al. Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation. Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).
- Csete, M. Oxygen in the cultivation of stem cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).
- Johansson, A., et al. Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).
- Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).
- Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line. PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).
- Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).
- Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Court, M., et al. Toward a standardized urine proteome analysis methodology. Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).
- Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
- Liebler, D. C., Ham, A. -. J. L. Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics. Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).
- Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis. Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).
- Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells. Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
- Lengner, C. J., et al. Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations. Cell. 141 (5), 872-883 (2010).
- Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology. Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).
