Quantificazione di esaltazione anticorpo-dipendente del Virus in cellule umane primarie Zika
Summary
Descriviamo un metodo per valutare l’effetto di pre-esistenti immunità contro il virus della dengue sull’infezione del virus di Zika utilizzando siero umano, cellule umane primarie e quantificazione di infezione da reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale.
Abstract
Il recente emergere del flavivirus Zika e complicazioni neurologiche, quali sindrome di Guillain-Barré e microcefalia in infanti, ha portato sicurezza pubblica gravi preoccupazioni. Tra i fattori di rischio, esaltazione anticorpo-dipendente (ADE) rappresenta la minaccia più significativa, come la recente ricomparsa del virus Zika (ZIKV) è principalmente nelle zone dove la popolazione è stata esposta ed è in uno stato di pre-immunità agli altri strettamente connessi flavivirus, specialmente virus dengue (DENV). Qui, descriviamo un protocollo per quantificare l’effetto degli anticorpi del siero umano DENV sull’infezione di ZIKV in cellule umane primarie o linee cellulari.
Introduction
Tra le malattie virali trasmesse da zanzare, Zika infezione è uno del più clinicamente importante1. L’infezione è causata da flavivirus ZIKV che, nella maggior parte dei casi, utilizza Aedes aegypti come suo principale vettore1,2. Tuttavia, ci sono studi che hanno segnalato Aedes albopictus come un vettore primario in alcuni focolai ZIKV3. Anche se l’infezione è asintomatica in molti casi, i sintomi più comuni sono febbre, mal di testa e muscolo dolore2. Non c’è nessuna cura o vaccino disponibile per infezione ZIKV e il trattamento disponibile per la maggior parte è favorevole. Recente insorgenza di ZIKV in Sud America ha portato a gravi casi di malattia e un aumento di circa 20 volte nel disordine dello sviluppo neurologico nei feti che si chiamano microcefalia2. Come il Sud America è una zona endemica per diversi arbovirus come DENV e West Nile virus, è fondamentale indagare se preventiva immunità alle altre flavivirus(es) gioca un ruolo nella severità delle infezioni ZIKV e malattia.
Nel corso dei secoli, i virus hanno evoluto strategie differenti per aumentare le proprie chance di infettività al fine di prendere in consegna la macchina di cellula ospite e sopprimere la risposta antivirale. Uno dei più affascinanti di tutti è l’uso degli host anticorpi pre-immune dai virus per migliorare la loro replica con il fenomeno ADE4. ADE in tutti i quattro sierotipi di DENV è stata ben studiata e ha dimostrato di aumentare i titoli virali e malattia risultato5,6,7. In un precedente studio in vitro, abbiamo dimostrato un miglioramento significativo della replica di ZIKV a causa di preesistenti immunità DENV in cellule immuni umane primarie8. Inoltre, abbiamo dimostrato un metodo in vitro pertinente per quantificare la capacità degli anticorpi preesistenti DENV per migliorare la replica di ZIKV in cellule primarie.
Il protocollo che abbiamo sviluppato utilizza campioni di siero umano che vengono testati per la neutralizzazione di DENV in TCID 50 o prova di neutralizzazione di riduzione della placca (PRNT) assays, insieme con ZIKV in cellule biologicamente rilevanti o cellule derivate dai tessuti che possono infettare ZIKV.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cross-reattività degli anticorpi DENV verso l’ADE di altri sierotipi DENV ha ostacolato lo sviluppo di un vaccino efficace11. ZIKV appartiene alla stessa famiglia, Flaviviridae e ha una notevole omologia con altri flavivirus, soprattutto DENV12. Il bersaglio principale degli anticorpi neutralizzanti per ZIKV e DENV è la proteina dell’involucro, che condivide un’omologia di sequenza strutturale e Quaternario molto elevato tra i due virus13,</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato generosamente supportato da 1R21AI129881-01 (al t.m.c.), fondi di Start-up dal National Laboratories malattie infettive emergenti e la Boston University School of Medicine.
Materials
| Fetal Bovine Serum | GEMINI | 100-106 | |
| iCycler | BioRad | 785BR02188 | Model No. CFX96 Optics Module |
| Microfuge 18 Centrifuge | Beckman Coulter | 367160 | |
| Nanodrop-1000 | Thermoscientific | 1072 | |
| Quantifast SYBR-One step RT-PCR kit | Qiagen | 204154 | Used for 1 step RT-qPCR |
| RNeasy RNA Isolation Kit | Qiagen | 74106 | Used for RNA extraction |
| RPMI-medium | Gibco | 11875093 |
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