Quantificação de realce dependente de anticorpo do vírus nas células humanas primárias Zika
Summary
Nós descrevemos um método para avaliar o efeito da imunidade pré-existente contra vírus da dengue sobre a infecção pelo vírus Zika usando soro humano, células humanas primárias e quantificação de infecção por reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa.
Abstract
O recente surgimento dos flavivirus Zika e complicações neurológicas, como síndrome de Guillain-Barré e microcefalia em lactentes, tem trazido preocupações sérias de segurança pública. Entre os fatores de risco, realce dependente de anticorpos (ADE) é uma ameaça a mais significativa, como o recente ressurgimento do vírus Zika (ZIKV) é principalmente em áreas onde a população foi exposta e está em um estado de pré-imunidade para outras estreitamente relacionadas flavivírus, especialmente o vírus da dengue (DENV). Aqui, descrevemos um protocolo para quantificar o efeito dos anticorpos de soro humano contra DENV na infecção ZIKV em células humanas primárias ou linhas celulares.
Introduction
Entre as doenças virais transmitidas por mosquitos, Zika infecção é um do mais clinicamente importantes1. A infecção é causada pelo flavivirus ZIKV que, na maioria dos casos, usa o Aedes aegypti como seu principal vetor1,2. No entanto, existem estudos que relataram Aedes albopictus como um vetor primário em alguns focos ZIKV3. Embora a infecção é assintomática em muitos casos, os sintomas mais comuns são febre, dor de cabeça e dor de músculo2. Não há cura ou vacina disponível para infecção ZIKV e o tratamento disponível na maior parte é favorável. Surtos recentes de ZIKV na América do Sul levaram a casos graves da doença e aumento do distúrbio neurológico em fetos chamada microcefalia2aproximadamente 20-fold. Como a América do Sul é uma zona endémica de vários arbovírus como vírus DENV e do oeste do Nilo, é crucial investigar se imunidade prévia para outros flavivirus(es) desempenha um papel na gravidade de infecções ZIKV e doença.
Ao longo dos tempos, os vírus evoluíram diferentes estratégias para aumentar suas chances de infecciosidade para assumir a maquinaria de célula do hospedeiro e suprimir a resposta antiviral. Uma das mais fascinantes de todos é o uso de anticorpos pre-imune do hospedeiro por vírus para realçar sua replicação com o fenômeno ADE4. ADE em todos os quatro sorotipos de DENV tem sido bem estudada e demonstrada para aumentar a concentração viral e doença resultado5,6,7. Em um estudo in vitro anterior, mostramos uma melhoria significativa da replicação de ZIKV devido ao pré-existente imunidade DENV em células do sistema imunológico humano primário8. Também demonstrámos um método in vitro relevante para quantificar a capacidade dos anticorpos pré-existentes DENV para melhorar a replicação de ZIKV em células primárias.
O protocolo que desenvolvemos usa amostras de soro humano que são testadas para a neutralização de DENV TCID-50 ou ensaios de teste de neutralização de redução de placas (PRNT), juntamente com ZIKV em células biologicamente relevantes ou células derivadas de tecidos que ZIKV pode infectar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Reatividade cruzada de anticorpos DENV levando para o ADE de outros sorotipos DENV tem dificultado o desenvolvimento de uma vacina eficaz11. ZIKV pertence à mesma família, Flaviviridae e tem uma considerável homologia com outros flavivírus, especialmente DENV12. O alvo principal de anticorpos neutralizantes para ZIKV e DENV é a proteína de envelope, que compartilha uma homologia de sequência estrutural e quaternário muito alta entre os dois vírus1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi generosamente apoiado por 1R21AI129881-01 (a T.M.C), start-up fundos de emergentes infecciosas doenças laboratórios nacionais e o Boston University School of Medicine.
Materials
| Fetal Bovine Serum | GEMINI | 100-106 | |
| iCycler | BioRad | 785BR02188 | Model No. CFX96 Optics Module |
| Microfuge 18 Centrifuge | Beckman Coulter | 367160 | |
| Nanodrop-1000 | Thermoscientific | 1072 | |
| Quantifast SYBR-One step RT-PCR kit | Qiagen | 204154 | Used for 1 step RT-qPCR |
| RNeasy RNA Isolation Kit | Qiagen | 74106 | Used for RNA extraction |
| RPMI-medium | Gibco | 11875093 |
References
- Hayes, E. B. Zika virus outside Africa. Emerging Infectious Diseases. 15, 1347-1350 (2009).
- Grard, G., et al. Zika virus in Gabon (Central Africa) – 2007: a new threat from Aedes albopictus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681 (2014).
- Fauci, A. S., Morens, D. M. Zika Virus in the Americas–Yet Another Arbovirus Threat. New England Journal of Medicine. 374 (7), 601-604 (2016).
- Hawkes, R. A. Enhancement of the Infectivity of Arboviruses by Specific Antisera Produced in Domestic Fowls. Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 42, 465-482 (1964).
- Musso, D., Gubler, D. J. Zika Virus. Clinical Microbiology Reviews. 29 (3), 487-524 (2016).
- Vaughn, D. W., et al. Dengue viremia titer, antibody response pattern, and virus serotype correlate with disease severity. The Journal of Infectious Diseases. 181 (1), 2-9 (2000).
- Khandia, R., et al. Modulation of Dengue/Zika Virus Pathogenicity by Antibody-Dependent Enhancement and Strategies to Protect Against Enhancement in Zika Virus Infection. Frontiers of Immunology. 9, 597 (2018).
- Londono-Renteria, B., et al. A relevant in vitro human model for the study of Zika virus antibody-dependent enhancement. Journal of General Virology. 98 (7), 1702-1712 (2017).
- Ganger, M. T., Dietz, G. D., Ewing, S. J. A common base method for analysis of qPCR data and the application of simple blocking in qPCR experiments. BMC Bioinformatics. 18 (1), 534 (2017).
- Renn, L. A., et al. High-throughput quantitative real-time RT-PCR assay for determining expression profiles of types I and III interferon subtypes. Journal of Visualized Experiments. (97), e52650 (2015).
- McArthur, M. A., et al. Dengue vaccines: recent developments, ongoing challenges and current candidates. Expert Review of Vaccines. 12 (8), 933-953 (2013).
- Priyamvada, L., et al. Humoral cross-reactivity between Zika and dengue viruses: implications for protection and pathology. Emerging Microbes and Infections. 6 (5), 33 (2017).
- Dai, L., et al. Molecular basis of antibody-mediated neutralization and protection against flavivirus. IUBMB Life. 68 (10), 783-791 (2016).
- Dai, L., et al. Structures of the Zika Virus Envelope Protein and Its Complex with a Flavivirus Broadly Protective Antibody. Cell Host & Microbe. 19 (5), 696-704 (2016).
- Sirohi, D., et al. The 3.8 A resolution cryo-EM structure of Zika virus. Science. 352 (6284), 467-470 (2016).
- George, J., et al. Prior Exposure to Zika Virus Significantly Enhances Peak Dengue-2 Viremia in Rhesus Macaques. Scientific Reports. 7 (1), 10498 (2017).
- Morens, D. M., Halstead, S. B. Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies. Journal of General Virology. 71, 2909-2914 (1990).
- Dejnirattisai, W., et al. Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans. Science. 328 (5979), 745-748 (2010).
- Priyamvada, L., et al. Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (28), 7852-7857 (2016).
- Charles, A. S., Christofferson, R. C. Utility of a Dengue-Derived Monoclonal Antibody to Enhance Zika Infection In Vitro. PLoS Currents. 8, (2016).
- Swanstrom, J. A., et al. Dengue Virus Envelope Dimer Epitope Monoclonal Antibodies Isolated from Dengue Patients Are Protective against Zika Virus. MBio. 7 (4), (2016).
