MeshAndCollect を使用して蛍光タンパク質セルリアンの構造解析

1 セルリアンの発現と精製 注: これは Lelimousinらによって公開されたプロトコルに基づいて、21 エシェリヒア属大腸菌 BL21 セル外径 φ600まで自動誘導中23の 4 L で 37 ° C で成長の彼の付けられたセルリアンの表現 = 1 とし、27 ° C で一晩インキュベート 5,000 × gで細菌の細胞を収穫し、超音波で細胞を溶解 (40%、5 分、10 秒パルス、10 秒の一時停止) の 20 mM Tris pH 8.0、500 mM の NaCl と EDTA 無料プロテアーゼ阻害剤 × 1 で構成されるバッファーの 200 mL の。 彼トラップ Ni NTA 列に上清を読み込み、同じバッファー条件で 100 mM のイミダゾールとセルリアンを溶出します。 明るい黄色着色された分数をプールします。タンパク質は色は本質的に、それゆえセルリアン含む画分がわかりやすい。 20 mM Tris pH 8.0 の S75 列に (4 mL) の蛋白質を浄化します。 明るい黄色の分数をプール、15 mg/mL に蛋白質の解決を集中します。 2. 結晶化 ハンギング ドロップ蒸気拡散法24で Linbro プレート 20 ° C。100 mM HEPES 12 %peg8000 及び 100 mM MgCl 6.75、ph から成る沈殿溶液 1 mL と井戸を埋める2.ハングの低下、蛋白変性溶液 1 μ L と 15 mg/mL に集中して 1 μ L を混在させます。結晶は、24 h で表示されます。 得られた結晶と 0.1 M HEPES pH 6.75、22% から成るシード バッファーの 100 μ L には 8000 をペグ転送を収穫します。 結晶を 0.1 mL 組織グラインダーで挽くし、バッファー (比率 1: 100) の播種で希釈します。 1 h (1:10 (v/v)) のトリプシン (同じバッファーに 0.5 mg/mL) 蛋白質原液 (15 mg/mL) の因数を消化します。 消化されたタンパク質溶液を混ぜて 10% の種を含むバッファー (v/v)。 結晶を成長させる (10 * 10 * 20 μ m3) 14% 止め釘の 8000、0.1 M HEPES pH 7 で 0.1 MgCl2 1 1.5 μ ハンギング ドロップ蒸気拡散法を用いたします。 3. 結晶のマウント 例えば、脊椎標準試料ホルダー25にマウントされている各 25 μ m のメッシュ ループ 700 角穴適切なループを使用してください。凍結溶液 (グリセロール (最終 20% (v/v)) を混ぜても沈殿溶液) の 1 μ L に結晶化ドロップ (ステップ 2.6) から結晶を転送します。 結晶の下のループを移動し、ドロップダウンからそれらを持ち上げるメッシュ ループに蛋白質結晶スラリーをマウントします。理想的に結晶は 5 μ m-のループ マウント結晶も重なり最大寸法で 30 μ m の大きさの範囲にする必要があります。 ろ紙をすぐにマウントを触れることにより、余分な液体を放出します。堆積物、結晶、できるだけ少しのバルク液体に囲まれたループの平面に座る。 マウントを液体窒素の完全 unipuck に突入します。ビームタイムが利用可能になるまで、適切なストレージ コンテナーで 100 K でパックを格納します。 4 放射光実験のオフラインの準備 注: できるだけ早く放射光ビーム時間を要求し、利用可能なアクセスの種類および特定放射光のアプリケーションを提出する方法についてオンラインのガイドラインに従ってください。ESRF ガイドラインは、http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying で見つけることが。ESRF ブロック アロケーション グループ (袋) のメンバー、各プロジェクト固有のアプリケーションは必要ありません。この場合は実験者ビームタイムのスケジューリングに関する彼らのバッグ担当に近づきます。 提案が受け入れられるし、実験のための招待状を受け取った、安全訓練を完了するすべての参加者があります。「A フォーム」(を介してESRF ユーザー ポータル, http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form) サンプルに必要な安全情報を入力します。実験を説明するローカルの担当者にお問い合わせください。一度あなたの A フォームがサブミットされ、検証実験番号とパスワードそれ与えるでしょう。 拡張 ISPyB26 (http://www.esrf.fr/) に接続し、 MXを選択します。 実験番号と A フォームからパスワードでログインします。 貨物を選択 |新規追加、要求された情報を入力します。 追加区画を選択し、関連するデータを入力します。追加のコンテナーを選択して、unipuck をパックに試料ホルダーの位置を含む、必要な情報を入力します。 5. ビームラインにサンプルの読み込み 実験ハッチ内検体チェンジャー (SC) にパックを読み込むデュワーとその位置に注意してください。 実験のキャビンを連動して制御ハッチを入力します。 ISPyB (https://esrf.fr/) にログインします。実験の準備を選択、出荷を検索、次選択およびビームラインおよび SC のパックの位置を示す ログイン ビームライン制御ソフトウェア、ここに MXCuBE227,28数値実験と A フォームで提供されるパスワードを使用します。 ISPyB データベースとビームライン制御ソフトウェアを同期する同期を押してください。 ビームライン制御ソフトウェアを使う、ゴニオメータにサンプル ホルダーをマウントします。MXCuBE2、サンプル チェンジャー領域内の位置を右クリックし、マウントのサンプルを選択します。 活用してインストール MK3 ミニ カッパ計29せいぜい ESRF MX ビームラインの MXCuBE2 の「視覚的再編」ワークフローにを使用30ゴニオメータ回転の軸と試料ホルダー面を揃えます。 ループの先端のエッジの中央に、3 をクリックしてセンターのセンターボタンを選択します。中心の位置を保存を選択して保存します。 その 3 [センター ループの幹の開始の中センターボタンを再度クリックします。保存をクリックしても 2 番目の位置を保存します。 それをクリックして保存の中心位置のいずれかを選択します。 詳細設定の下には、MxCuBE2 データ コレクション キューにワークフローの視覚的方向転換を追加します。 収集キューをクリックして、ワークフローを起動します。 ワークフロー後、ゴニオ メーター、センター サンプル ホルダーを再び、今回はメッシュの途中でどこかの回転の軸と試料ホルダー面を揃えます。 メッシュの顔が MXCuBE2 を使用してオメガ軸を回転させることにより x 線ビーム方向に垂直なサンプル ホルダーに合わせます。 MXCuBE2、(のみのサイズが可変ビーム ビームライン) サンプル ホルダーのスキャンに必要な梁サイズを選択します。 絞りビームライン制御ソフトウェアのメニュー ドロップダウンをクリックし、値、例えば10 μ m を選択します。 メッシュ スキャンのメッシュを定義します。 MXCuBE2 のメッシュ ツール アイコンをクリックします。メッシュ ツール ウィンドウが表示されます。 MXCuBE2 のサンプル ビューで左クリックして、サンプル ホルダーに結晶を含む領域の上にマウスをドラッグしてメッシュを描画します。 保存メッシュ ツール ウィンドウでプラスのボタンをクリックして、メッシュ (メッシュが緑になる)。 6. 準備して MeshAndCollect ワークフローを実行 MXCuBE2 の [解像度] フィールドに、解像度 (d分) の回折で画像を収集する必要があります、例えば、ここの 1.8 Å を入力します。 データ コレクションの詳細設定] タブでMeshAndCollect 、それをキューに追加し、収集 、 キューをクリックします。 表示されるパラメーター ウィンドウでビームライン依存の既定のパラメーターを使用します。実験で説明した既定値のパラメーターは、メッシュのスキャン ポイント、100% 伝送 (この場合は 4 × 1011 ph/s につながる)、メッシュ走査線あたり 1 ° 振動 0.037 秒露光時間。 Continueをクリックします。メッシュのスキャンが実行され、各グリッド ポイントで収集された回折像の分析およびソフトウェア DOZOR1回折強度に応じてランク付け。このプロセスは、バック グラウンドで実行されます。 DOZOR 解析後ヒート マップが生成され、その後の部分的なデータ コレクションの注文が回折強度に基づいて自動的に割り当てられます (図 1参照)。注: この手順の結果は、ISPyB でも検査できます。ビームライン制御ソフトウェアの設定と新しいタブがポップアップ部分のデータ セットのコレクション、回転範囲 (すなわち、 0.1 °)、イメージ (すなわち100) の数、露光時間、解像度、伝送、適切な値を選択します。逆梁など理想的に収集するウェッジは、それぞれの線量は、・ ガーマン制限 (30 MGy) 以下でなければなりません。画像あたりのおおよその露出時間は 0.037 0.1 s 説明実験条件で s。 一部のデータ コレクションを開始する続行をクリックします。 7 データ処理 注: 一部のデータ セットは、適切なプログラム (XDS10) と統合されます。このため、Python スクリプトはそれぞれ個々 のデータ セットを認識し、それを統合、異なる部分データのインデックスが一貫性のあることを確認する使用されます。 画像を含むフォルダーを開く:/data/visitor/mxXXXX/beamline_name/date/RAW_DATA/Cerulean。 部分のデータ セットを収集する場所フォルダーで見つけることができますプロセス サブフォルダーの安全性のコピーを作成します。 Linux ターミナル コマンドcp-r プロセス process_backupを使用します。 プロセス フォルダーに移動し、処理スクリプトを起動します。 Linux ターミナルのコマンドcd プロセスを入力してエンターキーを押します。 型procMultiCrystalDataとヒットを入力します。注: スクリプト、空間群を求める、セル パラメーター (この情報は省略可能)、指示に従って入力します。最後のユーザー確認後スクリプトが自動的に実行されます。 8. データ セットのマージ 注: すべての部分的なデータ セットを統合後、構造決定、絞り込み用の最終データ セットを生成するそれらの最適な組み合わせがマージされます。この統合プロセスの別の目的は (強く推奨) における完全性、高い多様性または最高のデータの統計を取得することができます (高 低 R 要因、等)。後者がある多様性および/または完全性を犠牲にして注意してこのオプションを選択する必要がありますので。 プログラム ccCluster14を使用して部分的なデータ セットをマージします。階層的クラスター分析 (HCA) を使用して同形の部分的なデータ セット () の可能な組み合わせを決定します。 そのグラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) を開くには Unix のターミナルにccClusterを入力します。注: ccCluster GUI でデンドロが描画されます。これは、それらの間の同型性に基づく部分的なデータ セットが最高マージどの提案を与えます。 約 0.4 垂直軸上の値に対応するノードをクリックします。一般に、高い値のセットは、悪い部分のデータ セットが少ない同形になるよう統計情報をマージにつながる複数の部分のデータが含まれます。 データを結合をクリックします。バック グラウンドで選択したクラスターが処理され、推定結合統計が GUI で新しいタブに表示されます。データ セットのさまざまな組み合わせのため、この手順を繰り返すことができます。部分データ セットの良い組み合わせの完全性に近くなるはず 100% 高の値 (最低解像度シェル 10 以上) と R 測定31値低い (低解像度シェルで約 5%)。 選択された各組み合わせ単一 mtz ファイル (すなわち、無意味な32) に選ばれた部分のデータ セットをマージするのには生成された入力スクリプトを使用します。 決定的にスケール スケーリング プログラム (すなわち、あてのない32) を使用してこのファイルの強度データをマージし、アプリケーションとして単結晶データ コレクションからファイルに出力を使用以降段階的に廃止と構造ソリューション33.